肝脾同治方對哮喘小鼠Th17/Treg及Foxp3/ RORγt的影響

徐 麗，郭振武，賈連群，張 哲，王 英，張會永，宋 囡，岳志軍，李 然，王 巍，趙 娜，秦文艷，甘 雨，李 爽

（1.遼寧省中醫藥研究院，沈陽 110034；2. 遼寧中醫藥大學附屬第二醫院,沈陽 110034；3.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032；4. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110034）

支氣管哮喘是由多種炎性細胞、結構細胞等共同參與的一種慢性氣道炎癥性疾病，是兒科最常見的變態反應性疾病。隨著氣候環境等因素的改變，其發病率呈逐年上升的趨勢，嚴重影響兒童的身心健康，給家庭和整個社會帶來了極大的負擔[1-2]。支氣管哮喘有著強烈的遺傳免疫因素特點，T 淋巴細胞亞群表達異常與哮喘氣道炎癥反應相關。以往文獻及課題組研究顯示Th1 /Th2失衡是哮喘的重要免疫機制之一[3-4]。但隨著國內外研究的不斷深入，Thl/Th2失衡不能完全解釋哮喘的發生機制，Thl7細胞和調節性T細胞（Regulatory Tcell，Treg）及其代表性細胞因子IL-17、IL-10等與哮喘的發生機制存在著明顯相關[5-6]。RORγt是Thl7細胞分化的關鍵轉錄因子，Foxp3是Treg細胞調節功能關系密切的特異性轉錄因子，為進一步在Th17/Treg及轉錄后基因調控方面進行研究，本實驗旨在探討肝脾同治方是否與Th17/Treg及調控轉錄因子Foxp3/RORγt相關，觀察肝脾同治方對哮喘小鼠免疫失衡及可能的作用機制，以期證實肝脾同治方是否通過調節轉錄因子Foxp3/RORγt的失衡從而發揮臨床療效。

1 材料

1.1 動物 SPF級雌性 BALB/c 小鼠70只，體量（19.3±1.1）g，鼠齡6周 [ 遼寧長生生物技術有限公司，SCXK（遼）2015-0001]。隨機分為 6組：空白組、模型組、肝脾同治方低劑量組（簡稱低劑量組）、肝脾同治方中劑量組（簡稱中劑量組）、肝脾同治方高劑量組（簡稱高劑量組）、地塞米松組，10 只 /組。

1.2 干預藥物 肝脾同治方：陳皮、苦杏仁、麻黃、川貝等中藥共 121.5 g 減壓濃縮到 250 mL，終濃度為0.486 g/mL，參考文獻加水煎煮 3 次合并后過濾[7]，低溫放置備用。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 主要試劑 氫氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20141104）；卵清白蛋白（OVA，美國 Sigma）；高純總RNA快速提取試劑盒（北京BioTeke公司）；Primer設計合成（生工生物工程（上海）有限公司）；SYBR Green （北京Solarbio公司）；Super M-mLV反轉錄酶（北京BioTeke公司）；2×Power Taq PCR MasterMix （北京BioTeke公司）RNase固相清除劑（北京天恩澤基因科技有限公司）；小鼠IL-10、IL-17A、 TGF-β1酶聯免疫試劑盒（美國R&D 分裝）；PBS 緩沖液（pH = 7.4）、生理鹽水、蒸餾水實驗室自制。

1.3.2 主要儀器 YLS-8A 多功能誘咳引喘儀（山東省科學院設備站）；JJ2000Y 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；微量移液器（芬蘭BIOHIT公司，Proline）；熒光定量PCR儀（韓國BIONEER公司，Exicycler96）；超微量分光光度計（美國Thermo公司，NANO 2000）；旋渦震蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-901）。

2 方法

2.1 模型復制 建立 OVA 誘導的哮喘小鼠模型[8-9]。致敏階段：第1 天和第14天共2次，模型組與各藥物組每次每只小鼠給予2 mg 氫氧化鋁的混懸液0.2 mL與10 μg OVA腹腔注射，空白組給予生理鹽水腹腔注射；激發階段：第 28 ～34 天，空白組小鼠予生理鹽水霧化吸入激發，其他組予 1% OVA 溶液霧化吸入激發，1 次/d，每次 20 min。模型復制過程中，低劑量組小鼠死亡 1 只，經解剖為腹腔注射操作不當導致動脈出血所致。

2.2 干預方法 在小鼠造模激發階段，每次激發前30 min 稱重，進行灌胃干預，干預藥物、劑量及時間見表 1。

表 1 干預藥物、劑量及時間

空白組 10 19.4±1.3 蒸餾水 - 實驗第28天 7模型組 10 19.3±1.3 蒸餾水 - 實驗第28天 7低劑量組 9 19.3±1.6 肝脾同治方 3.95 實驗第28天 7中劑量組 10 19.3±1.6 肝脾同治方 7.90 實驗第28天 7高劑量組 10 19.3±1.6 肝脾同治方 15.80 實驗第28天 7地塞米松組 10 19.4±1.1 地塞米松片 1.56×10-3 實驗第28天 7

2.3 標本采集 行支氣管插管，用冰的 PBS 灌洗 3 次， 1 mL/次，回收率80% 以上為合格，離心，收集肺泡灌洗液上清液，于-20℃冰箱內冷凍保存。取下肺組織，生理鹽水沖洗后，迅速置于液氮中冷凍，后-80℃凍存，備用。

2.4 ELISA 法檢測血清 IgE、支氣管肺泡灌洗液 IL-10 、IL-17A、 TGF-β1水平變化。Real-time PCR檢測Foxp3/ RORγt基因表達：1）組織總RNA提取：根據試劑盒，各組樣本數值在1.8～2.2之間，OD260/OD280 nm下檢測。2）將提取的總RNA逆轉錄進行cDNA合成：反應體系：RT Primer（1 μM）1.2 μL，dNTP（2.5 mM each）0.75 μL，5×Buffer 4 μL，RNasin 0.25 μL，加ddH2O至總反應體系為19.8 μL。3）實時熒光定量PCR反應：Foxp3/ RORγt基因及β-actin內參基因引物順序如下表2，反應體系：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μM）各 0.5 μL，SYBR GREEN mastermix10 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，1 個循環；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃30 s，40個循環， 25 ℃ 5 min，1個循環。本實驗結果分析方法利用 2 - △△ CT 方法 。

表2 各基因引物序列

2.5 統計學分析 每組3個樣本，每個樣本設4個復孔平行實驗，舍去誤差較大數值，剩下數值的平均值作為最終保留數據，應用SPSS 17.0進行統計學分析。

3 實驗結果

3.1 哮喘小鼠一般狀態 空白組小鼠無明顯癥狀，精神狀態良好，呼吸平穩。模型組小鼠出現煩躁不安，易驚，毛色無光澤，頭面部瘙癢，抓鼻抓腮，點頭樣喘息，呼吸急促困難，呼吸程度加深，有明顯的腹式呼吸等哮喘發作癥狀[3]。

3.2 肺組織病理學觀察 空白組肺泡形態結構完整，無炎癥細胞浸潤，管腔內無脫落的支氣管上皮細胞及滲出物。模型組：肺泡壁變薄，排列紊亂，支氣管及其伴行氣管周圍有大量炎癥細胞浸潤，支氣管上皮黏膜脫落，黏膜褶皺增多，管腔內炎癥分泌物增多，支氣管管壁及氣道平滑肌層明顯增厚[3]。

3.3 各組 IL-17A、IL-10、TGF-β1的測定結果 見表3。

與空白組比較，模型組和各藥物治療組支氣管肺泡灌洗液IL-17A、TGF-β1值顯著升高（P＜0.05），IL-10值顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物治療組IL-17A、TGF-β1值顯著降低（P＜0.05），IL-10值顯著升高（P＜0.05）。

表3 哮喘小鼠IL-17A、IL-10、TGF-β1的測定結果（± s ） pg/mL

表3 哮喘小鼠IL-17A、IL-10、TGF-β1的測定結果（± s ） pg/mL

組 別 IL-17A IL-10 TGF-β1空白組 83.61±25.87 1656.52±95.78 70.98±23.88模型組 188.68±14.44△△735.09±61.72△△ 159.17±22.03△△

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

3.4 小鼠肺組織中Foxp3/ RORγt的表達情況 與空白組比較，模型組Foxp3表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量組、地塞米松組的Foxp3表達量顯著升高（P＜0.05）；其中高劑量組Foxp3表達量最高。與空白組比較，模型組RORγt表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各劑量組、地塞米松組的RORγt表達量顯著降低（P＜0.05），地塞米松組RORγt表達量最低，高劑量組RORγt表達量低于其余劑量組，結果見表4。

表4 肺組織Foxp3/ RORγt mRNA表達的情況（± s ）

表4 肺組織Foxp3/ RORγt mRNA表達的情況（± s ）

組 別 n Foxp3 RORγt空白組 3 1.87±0.35 0.58±0.09模型組 3 0.92±0.15△△ 2.09±0.20△△低劑量組 3 1.08±0.02# 1.61±0.24##

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

4 討論

小兒哮喘是兒科常見的呼吸系統疾病，以反復的咳喘、呼吸困難等為主要癥狀[10]。哮喘的發病機制復雜，至今尚無完整學說可以闡明[11]。臨床上，在非急性發作期時，多數情況下患兒咳喘表現雖然不重，但是存在癥狀消失緩慢、病程較長或者反復出現咳喘等情況，給患兒的學習生活帶來諸多不便[12]。目前西醫治療常用糖皮質激素、白三烯受體拮抗劑等抑制哮喘炎癥，但遠期療效并不滿意，并且安全性存在一定的問題[13-14]。中醫治療本病具有獨特的優勢，根據小兒“肝常有余”“脾常不足”的生理特點及五臟相關理論，肝脾同治方用于治療小兒哮喘，具有一定的理論基礎和臨床意義。哮喘慢性氣道炎癥發病機制復雜，促炎的Thl7細胞和抑炎的Treg細胞相互對立，相互制約以維持動態平衡，一旦Thl7/Treg平衡失調，Thl7分化增多，出現相關炎性反應的病理形式，導致哮喘的發生。本實驗結果發現模型組小鼠IL-17A值顯著升高，IL-10值顯著降低，在某種程度上證實了Th17/Treg免疫失衡是哮喘慢性氣道炎癥的重要環節之一，與文獻報道[15-16]哮喘小鼠IL-17A細胞數量增多而IL-10細胞數量減少結果一致。

Foxp3是Treg細胞特異的關鍵轉錄因子， RORγt是Thl7細胞分化必不可少的轉錄因子， Foxp3和RORγt最終決定了Treg/Thl7分化方向。Foxp3是轉錄因子forkhead/ winged-hellx（叉頭樣/翼狀螺旋）家族的成員[17]，Foxp3在調節性T細胞的發育和功能中起著決定性作用。RORγt是維甲酸相關核孤兒受體（retinoid-related orhan receptors，ROR）的家族成員之一，是Thl7分化的特異性關鍵轉錄因子，僅在淋巴細胞中表達，受STAT3的調控，RORγt的缺失會導致Thl7的分化缺失。

哮喘小鼠肺組織中RORγtmRNA高表達，提示小鼠在致敏原的刺激下，肺組織中單核巨噬細胞、上皮細胞等分泌大量的TGF-β，TGF-β是影響Thl7細胞分化過程中的關鍵的細胞因子，同時也是影響Treg分化的重要調節因子。在TGF-β等局部炎癥的作用下，引起RORγt基因高表達，誘導初始T細胞向Thl7分化。IL-l7與上皮細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎性細胞表面的IL-l7受體結合，進一步釋放各種炎癥因子、趨化因子，進一步促進炎癥的發生。通過實驗我們證實了哮喘小鼠慢性氣道炎癥與Foxp3/RORγt平衡一致的Treg/Thl7相關，哮喘小鼠Foxp3/RORγt轉錄因子的失衡表達，很可能導致Th0向Thl7優勢分化，引起哮喘的免疫失衡狀態。各劑量組均表現出Foxp3mRNA水平的升高和RORγtmRNA水平的降低，以高劑量組最為明顯。提示肝脾同治方可能通過升高了血清中IL-10水平、降低血清中IL-17、TGF-β1水平，降低肺組織RORγtmRNA水平，升高肺組織Foxp3mRNA水平而起到良性調節Thl7/Treg平衡機制的效應，起到調節哮喘小鼠慢性氣道炎癥的作用。