益氣活血中藥對慢性心衰大鼠NT-proBNP和cTnI的影響

康 伊，張 艷，張 偉

（1.遼寧中醫藥大學，沈陽 110032；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032）

慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）被認為主要與血流壓力改變引發冠狀動脈血管重塑有關[1]。心臟重塑常被認為是一種不可逆的心臟病，與預后不良有關。益氣活血中藥組方已報道可提高氣虛血瘀型慢性心衰患者的生活質量和運動耐力[2]，但采用哪種生化指標檢測和衡量益氣活血中藥組方的治療效果還有待研究。N末端B型利鈉肽前體（Nterminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）和心肌肌鈣蛋白I（Cardiac troponin I，cTnI）都是目前慢性心力衰竭臨床診斷過程中有效、靈敏的生化檢測指標[3-4]。血清NT-proBNP在心室擴張及容量負荷過重時分泌增加，在心肌細胞受到拉伸刺激后pro-BNP在蛋白酶的作用下等摩爾量裂解為無活性NT-proBNP。NT-proBNP是目前在管理心衰疾病中的鑒別診斷、危險評級、預后判斷和治療監測中有重要意義。血清cTnI則是反映心臟損傷的高敏感性、高特異性標志物，當心肌受損后，cTnI對于心衰患者預后預測具有重要意義[5]。本研究通過觀察益氣活血中藥對慢性心力衰竭模型大鼠的療效，檢測不同中西藥處理后慢性心衰大鼠血清NT-proBNP和cTnI水平，探索衡量和評估益氣活血中藥組分對慢性心衰治療的重要生化指標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 使用遼寧長生生物技術有限公司提供的、經檢測健康的SPF級雄性SD大鼠80只。

1.2 儀器與設備 賴諾普利片（批號：HI0960265）購自上海阿斯利康有限公司，每片10 mg；益氣活血中藥：由人參、丹參、黃芪、三七粉、紅花五味中藥組成；中藥復方制劑：購自江陰天江藥業有限公司。NT-proBNP測定采用酶聯免疫（ELISA）法，試劑盒由美國ADL公司提供。cTnI的測定采用電化學發光法，試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司。小動物呼吸機HX-300，購自廣州深華生物技術有限公司。彩色多普勒超聲機SONO S5500購自Agilnet公司。酶標儀購自上海皓莊儀器有限公司。電熱鼓風干燥箱，由天津泰斯特儀器有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 心衰大鼠模型構建 隨機選取20只大鼠作為空白組，剩余60只大鼠進行左前降支動脈結扎手術[6-7]：按照0.3 mL/100 g比例腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰臥位固定于手術臺上，經口自聲門插入氣管，外聯HX-300小動物呼吸機,呼吸頻率為80次/min，潮氣量為0.8 mL。用碘酒消毒術區，定位第3肋，并以左胸第3肋間為切口，逐層切開皮膚、胸大肌，暴露肋骨，利用開胸器擴胸后，在左心耳和肺動脈圓錐之間找到左冠狀動脈前降支，并在其起源點下2～4 mm處用美容線結扎，當周圍心肌變白時，將心臟重置于胸腔，清理好胸腔內淤血和外源污染物。使用3號線逐層關胸，皮下注射5 mL生理鹽水，在暖燈下等待呼吸狀態平穩后停小動物呼吸機，觀察大鼠自主呼吸后，拔出氣管插管針。將大鼠四肢插入電針，進行心電圖顯示胸導ST-T段抬高表明結扎成功。術后1次/d、連續3天注射青霉素鈉3萬單位抗感染治療。術后存活大鼠常規喂養一周后，采取半量飼料饑餓喂養，每天力竭式游泳一次，時間隨大鼠狀態逐步縮短，持續4周。訓練期間模型大鼠出現精神萎靡，活動度減低，脫毛，喉間哮鳴音等體征。通過心臟彩照檢測左室射血分數（EF）≤50%作為慢性心衰造模成功標準，列入下一步實驗對象。

1.3.2 分組及給藥 建模手術成功41只大鼠隨機分為建模組（13只）、賴諾普利組（14只）和益氣活血組（14只）。同時空白組通過隨機抽取法留取15只大鼠。空白組和建模組分別進行等容積蒸餾水灌胃，1次/d。賴諾普利組和益氣活血組按照人鼠劑量換算公式給藥。賴諾普利組按生藥1.5 mg（ /kg/d） 的劑量給予賴諾普利，灌胃，1次/d，益氣活血組按生藥4.6 g生藥/（kg/d），灌胃，1次/d。各組均持續給藥28 d。

1.3.3 取材及檢測方法 由于灌胃給藥期間建模組和治療組大鼠出現不同程度的死亡，每組大鼠剩余數目仍大于等于10只，因此，在后期的實驗中每組大鼠再次采用隨機數字表法各取10只進行檢測。大鼠持續給藥28 d后，經過禁食不禁水處理12 h后，麻醉處死全部大鼠。通過腹主動脈取血4 mL，在室溫條件下自然凝固20 min，3 000 r/min離心20 min。仔細收集上清液，低溫保存。

1.3.4 血清NT-proBNP測定 依照NT-proBNP試劑盒說明書步驟操作對標準品依次進行稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、顯色，在450 nm波長下，測定各孔的吸光度（OD值），最后計算樣品實際濃度。

1.3.5 血清cTnI測定 采用電化學發光免疫法在Roche cabas E601 全自動免疫分析儀上檢測，試劑盒購于Roche公司。

1.4 統計學方法 使用SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計分析，結果使用均數±標準差（± s ）形式表示，使用完全隨機分組法進行組間比較，如果方差不齊采用Dunnett檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 利用血清NT-proBNP水平驗證檢測益氣活血中藥組方療效，見表1和圖1。

建模組比和空白組相比，血清NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.01），表明建模組血清NT-proBNP水平明顯高于空白組，證明慢性心力衰竭時NT-proBNP含量呈增高趨勢。益氣活血組和賴諾普利組與建模組比較，大鼠血清中NT-proBNP水平都顯著降低（P＜0.01），而益氣活血組與賴諾普利組組間比較血清NT-proBNP水平沒有統計學意義（P＞0.05），說明益氣活血中藥與賴諾普利片的療效基本相當。以上數據表明益氣活血中藥和西藥賴諾普利片對慢性心力衰竭大鼠均有治療作用并且都能顯著降低血清NT-proBNP的水平。

表1 各組大鼠血清中NT-proBNP含量（± s ）

表1 各組大鼠血清中NT-proBNP含量（± s ）

注：與空白組比較，# P＜0.01；與建模組比較，△P＜0.01

組 別 n NT-proBNP（ng/mL）空白組 15 0.35±0.05建模組 13 1.56±0.11#益氣活血組 14 1.06±0.07#△賴諾普利組 14 1.05±0.08#△

圖1 各組大鼠血清NT-proBNP水平的測定和統計分析

2.2 利用血清cTnI水平驗證檢測益氣活血中藥組方的治療療效見表2和圖2。

建模組與空白組相比，血清cTnI水平顯著升高（P＜0.01），表明建模組血清cTnI水平含量高于空白組，提示了心力衰竭時cTnI含量呈增高趨勢。益氣活血組與賴諾普利組與建模組相比較，慢性心衰大鼠血清cTnI水平明顯降低（P＜0.01），益氣活血組與賴諾普利組組間比較血清cTnI水平沒有統計學意義（P＞0.05），表明益氣活血中藥及賴諾普利片的療效基本相當。以上數據說明益氣活血中藥和西藥對慢性心力衰竭大鼠均有治療作用并且明顯降低血清cTnI的水平。

表2 各組大鼠血清中cTnI含量（± s ）

表2 各組大鼠血清中cTnI含量（± s ）

注：與空白組比較，# P＜0.01；與建模組比較，△P＜0.01

組 別 n cTnI（pg/mL）空白組 15 154.89±11.55建模組 13 394.50±28.34 #益氣活血組 14 282.92±22.93#△賴諾普利組 14 278.89±17.88#△

圖2 各組大鼠血清cTnI水平的測定和統計分析

3 討論

3.1 NT-proBNP、cTnI與慢性心力衰竭的關系 B型利鈉肽主要來源于心室釋放，表明心臟也是一個內分泌器官。BNP最初是在豬腦中發現的，但后來發現其在心臟中濃度最大。108個氨基酸的pro BNP釋放后可被等摩爾裂解成32個氨基酸的活性BNP和76個氨基酸的NT-pro BNP[8]。有活性的BNP進而結合pGC-A受體（particulate guanylyl cyclase A receptor），從而增加第二信使cGMP的濃度，最終起到減少成纖維細胞和平滑肌細胞增殖、降低交感神經活性、促進利尿、血管舒張、抑制心臟肥厚和纖維化、抑制腎素-血管緊張素—醛固酮系統以及代謝保護功能的作用。兩種多肽半衰期不同，有活性的BNP主要被腦啡肽酶NEP降解半衰期僅為22 min，而NT-proBNP則不依賴NEP的降解半衰期為2 h。臨床上NT-proBNP已經作為診斷和判斷慢性心衰預后的重要生物標記物，纈沙坦心力衰竭試驗（Val-HeFT研究）證明了NT-proBNP對晚期心力衰竭患者診斷的有效性，NT-pro BNP濃度在NYHAIII 或IV期擴張型心肌病和心血管病患者中顯著升高[9]。由Zile等人主導的分析NT-proBNP與心衰患者預后的大型臨床分析PARADIGM-HF項目表明，NT-proBNP與心衰患者的預后密切相關[10]。王寶囡等人的研究表明NT-proBNP水平與心衰患者發生猝死或者再次住院高度相關[11]。鑒于血清中NT-pro BNP濃度檢測已被證明是非常有效的篩選技術，FDA已經批準利用NT-pro BNP進行評估充血性心力衰竭和急性冠狀動脈綜合征。

肌鈣蛋白（Troponin）復合物由C、T和I三種亞型組成，肌鈣蛋白C是鈣結合亞基，肌鈣蛋白T具有原肌球蛋白結合單元，而肌鈣蛋白I蛋白通過抑制肌動球蛋白ATP活性調節肌動蛋白-肌球蛋白的相互作用，是三元復合物中的抑制亞基[12]。cTnI分子量為27 kDa，只在心肌中存在而且控制著薄肌動蛋白對鈣離子的反應。在低鈣離子條件下，cTnI結合肌動蛋白阻止肌球蛋白與肌動蛋白的結合從而抑制力的產生；而在高鈣離子條件下，鈣離子通過結合cTnC導致cTnI與肌動蛋白分離，從而肌球蛋白與肌動蛋白結合促使心肌細胞產生收縮力。cTnI具有兩個部分：超過90%的心肌鈣蛋白I被綁定到肌原纖維中，僅有少部分處于細胞漿中的游離狀態。游離狀態的cTnI釋放入血更加迅速，僅在心肌受損后1～2 h內即有反應[13]。臨床觀察表明cTnI和T可以迅速釋放游離狀態的部分，在急性損傷后4～6 h血液含量開始升高，并可以持續6～8 d，因此cTnI可作為檢測心肌損傷的敏感指標[14]。除明顯的心肌壞死外，cTnI釋放另一個例子包括陣發性室上性心動過速后肌鈣蛋白升高。相比之下，肌原纖維結合的cTnI在急性損傷幾天后才逐步緩慢地釋放到血液中[15]。

3.2 益氣活血中藥對CHF的影響 慢性心衰主要表現為喘息氣短、呼吸困難、疲倦乏力、水腫等體肺循環淤血的癥狀[16]。慢性心衰中醫病機總屬本虛標實，其以氣虛、陽虛、陰虛為本，而尤以氣虛為根；以痰濁、血瘀、水飲為標，尤以血瘀為主[17]。現代中醫學研究認為，慢性心衰的發生與心腎氣虛關系最為密切。心腎氣虛是慢性心衰發生的基礎，且伴隨著慢性心衰的整個過程[18]。“瘀血”與“水腫”均為心腎氣虛的病理產物，其中“瘀血”是慢性心衰發生的重要環節[19]，而“水腫”的出現是慢性心衰的嚴重階段[20]。“氣行血行，氣滯則血停”，益氣活血中藥由黃芪、人參、丹參、三七粉、紅花組成：黃芪、人參補氣，并具有正性肌力作用等作用；丹參活血化瘀，調血斂血；三七活血止血；紅花活血化瘀。諸藥合用，起到活血化瘀、補氣理氣之功效。現代藥理學還認為，丹參能夠改善能量代謝和抑制細胞凋亡等[21]，為本方能夠調節心肌能量代謝提供了藥理依據。

4 結論

益氣活血中藥可以幫助產生心肌代謝所需的能量，減輕心肌損傷，從而改善慢性心力衰竭的癥狀并且為中醫藥防治慢性心力衰竭提供客觀的科學依據。