鹽酸左旋咪唑對免疫功能低下小鼠免疫功能的影響

林燕飛，張 琴，高芳芳*

（1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510000；2. 西安碑林藥業股份有限公司，陜西 西安 710048；3. 延安大學附屬醫院，陜西 延安 716000）

近年我國惡性腫瘤發病人數逐年增加，化療仍是目前治療惡性腫瘤的主要手段。化療會導致絕大多數患者免疫功能受損，誘發嚴重感染等并發癥[1-2]。所以開發免疫功能增強藥物具有重要意義。鹽酸左旋咪唑除了常作為驅蟲藥使用外，還具有免疫調節作用，可有效改善患者免疫功能[3-4]。本研究采用經典化療藥物環磷酰胺誘導免疫功能低下小鼠模型，觀察不同劑量鹽酸左旋咪唑對模型小鼠免疫功能的影響，現將結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器

UV-8000型雙光束觸屏紫外可見分光光度計（上海元析儀器公司）；CTK132C型離心機（湖南湘儀離心機儀器公司）；ME1002TE型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用環磷酰胺（德國Baxter Oncology GmbH，批號：20170325）；胸腺肽腸溶片（黑龍江迪龍制藥，批號：20170314）；鹽酸左旋咪唑（山東仁和堂藥業，批號：20170216）；二硝基氯苯、丙酮（國藥集團）；血清IgG酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海生工）。

1.3 實驗動物與飼養條件

昆明種小鼠，雄性，體重15～20 g，購自中國科學院斯萊克實驗動物中心（合格證號：SCXK京2011-0012），購回后適應性飼養2周后再用于實驗；維持動物房溫度22～25 ℃，濕度55%～65%，12 h/12 h光暗周期，自由飲食。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

昆明種小鼠隨機分為6組：空白組，模型組，胸腺肽10 mg/kg對照組，鹽酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg 3個劑量組，每組15只。各給藥組灌胃給予相應的藥物溶液10 ml/kg，每天1次，連續15 d。空白組和模型組給予等容積的生理鹽水。從給藥的第5天開始，除空白組外，其余5組均皮下注射環磷酰胺 40 mg/kg，每隔3 d注射1次，以制備免疫功能低下小鼠模型。

2.1.1 血清IgG含量測定及胸腺和脾臟指數計算 末次給藥后24 h，球后靜脈采血，3000 r/min離心15 min，分離血清。采用酶聯免疫吸附實驗測定血清IgG含量。然后頸椎脫臼法處死實驗小鼠，稱量胸腺和脾臟濕質量，計算臟器指數。胸腺指數=胸腺濕重/體質量，脾臟指數=脾臟濕重/體質量。

2.1.2 單核巨噬細胞吞噬能力檢測 采用碳粒廓清實驗檢測小鼠單核巨噬細胞吞噬能力，具體操作如下：末次給藥后24 h，按0.1 ml/10 g的量注射印度墨汁，分別于注射后2，12 min時取眼眶血20 μl，加入0.1%碳酸鈉溶液20 μl，搖勻后靜置10 min，測定680 nm處的光密度（OD）值。頸椎脫臼法處死實驗小鼠，稱量體質量、肝脾質量。吞噬指數（K）=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1），吞噬系數（α）=K×1/3×體質量/肝脾質量。

2.2 二硝基氯苯所致遲發型超敏反應實驗

分組、造模與給藥方法同2.1。末次給藥后24 h，小鼠頸部去毛，次日于去毛處涂抹50%二硝基氯苯丙酮溶液2 ml。次日，腹部皮膚再次涂抹50%二硝基氯苯丙酮溶液2 ml，激發。次日，尾靜脈注射1%伊文士藍，30 min后頸椎脫臼法處死，剝離腹部藍色皮膚，剪碎，用4 ml丙酮和生理鹽水（1:1）混合溶液浸泡24 h，離心取上清，測定610 nm處的OD值。

2.3 雞紅細胞血清溶血素實驗

分組、造模與給藥方法同2.1項。從給藥的第5天開始，除空白組外，其余5組均腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.2 ml。末次給藥后24 h，取股動脈血，3000 r/min離心15 min，分離血清。生理鹽水稀釋100倍后，取稀釋血清1 ml與5%雞紅細胞懸液0.5 ml混合，再加入10%豚鼠血清0.5 ml。37 ℃孵育30 min，0 ℃終止反應，離心取上清，測定540 nm處的OD值。

2.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0統計學軟件，所有計量數據用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組內比較采用LSD-t分析。計數數據以百分比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠血清IgG含量、胸腺和脾臟指數及單核巨噬細胞吞噬能力比較

與空白組比較，模型組血清IgG含量、胸腺和脾臟指數及K值和α值均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，胸腺肽組及鹽酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg組血清IgG含量、胸腺和脾臟指數及K值和α值均明顯提高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。鹽酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg組組間血清IgG含量、胸腺和脾臟指數及K值和α值差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表1。

表1 各組小鼠血清IgG含量及胸腺和脾臟指數比較（±s，n=15）

表1 各組小鼠血清IgG含量及胸腺和脾臟指數比較（±s，n=15）

注：*P＜0.05 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組；ΔP＜0.05 vs 鹽酸左旋咪唑15 mg/kg組；?P＜0.05 vs 鹽酸左旋咪唑5 mg/kg組

組別 劑量/mg·kg-1 IgG/μg·ml-1 胸腺指數/g·kg-1 脾臟指數/g·kg-1 K值 α值空白組 – 2.21±0.09 3.45±1.03 5.77±1.33 0.061±0.032 6.143±1.109模型組 10 1.44±0.13* 1.31±0.94* 2.14±0.98* 0.021±0.009* 4.431±0.563*胸腺肽組 10 2.00±0.10# 2.90±0.95# 4.87±1.21# 0.049±0.020# 5.976±0.994#1.68±0.08#Δ 2.17±0.84#Δ 3.89±1.15#Δ 0.030±0.014#Δ 4.447±0.067#Δ 10 1.84±0.12#Δ 2.78±0.91#Δ? 4.32±1.27#Δ? 0.041±0.017#Δ? 5.107±0.908#Δ?15 2.10±0.09# 3.12±1.00# 5.12±1.30# 0.052±0.024# 6.009±1.001#5鹽酸左旋咪唑組

3.2 各組小鼠遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值比較

與空白組比較，模型組遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，胸腺肽組及鹽酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg組遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值均明顯提高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。鹽酸左旋咪唑5，10，15 mg/kg組組間遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表2。

4 討論

免疫功能受損是惡性腫瘤化療的常見不良反應之一，臨床主要表現為食欲減退、身體疲乏、精神萎靡，檢查可發現白細胞和血小板水平降低，巨噬細胞、自然殺傷細胞活性降低等[5-6]。免疫功能受損可能加速癌細胞擴散或引起嚴重感染等發生，不利于患者的治療。所以開發免疫功能增強藥物具有重要意義。本研究采用經典化療藥物環磷酰胺誘導免疫功能低下小鼠模型，觀察不同劑量鹽酸左旋咪唑對模型小鼠免疫功能的影響。結果顯示：與空白組比較，模型組小鼠血清IgG含量、胸腺和脾臟指數、K值和α值、遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值均顯著降低。這也證實了化療藥物環磷酰胺可導致小鼠免疫功能低下。

表2 各組小鼠遲發型超敏反應和血清溶血素比較（±s，n=15）

表2 各組小鼠遲發型超敏反應和血清溶血素比較（±s，n=15）

注：*P＜0.05 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組；ΔP＜0.05 vs鹽酸左旋咪唑15 mg/kg組；?P＜0.05 vs 鹽酸左旋咪唑5 mg/kg組

5 0.400±0.117#Δ 0.431±0.120#Δ 10 0.487±0.139#Δ? 0.519±0.149#Δ?15 0.521±0.154# 0.599±0.165#/mg·kg-1遲發型超敏反應實驗OD值組別 劑量 血清溶血素OD值空白組 – 0.534±0.167 0.614±0.171模型組 10 0.209±0.087* 0.223±0.094*胸腺肽組 10 0.508±0.146# 0.547±0.143#鹽酸左旋咪唑組

血清IgG 是血清主要的抗體成分，約占血清Ig總量的75%，具有抗菌、抗病毒作用[7]。由于IgG結合補體、增強免疫細胞吞噬功能等發面的作用優于其他免疫球蛋白，所以血清IgG含量是反映體液免疫的重要指標[8]。胸腺、脾臟是機體主要免疫器官，是免疫反應的主要場所，所以測定胸腺和脾臟指數能反映免疫功能[9]。本研究結果顯示：與模型組比較，陽性對照組及低、中、高劑量組血清IgG含量、胸腺和脾臟指數均明顯提高，且低、中、高劑量組上述各指標比較差異均有統計學意義。提示鹽酸左旋咪唑可提高環磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下，且其效果呈劑量依賴性。

巨噬細胞是結締組織中的固有細胞，能吞噬和殺滅外界的病原微生物，也能處理自身損傷和衰老的細胞，能有效殺滅腫瘤細胞，其活性直接影響機體免疫應答的強弱程度[10-11]。所以增強吞噬細胞的吞噬能力可有效提高免疫功能。本研究采用碳粒廓清實驗檢測小鼠單核巨噬細胞吞噬能力，將印度墨汁自尾靜脈注射，經血液循環帶至脾臟等處，根據血液中碳粒濃度計算K值和α值。本研究結果顯示：與模型組比較，陽性對照組以及低、中、高劑量組K值和α值均明顯提高，且低、中、高劑量組比較差異均有統計學意義。提示鹽酸左旋咪唑可呈劑量依賴性提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力。

遲發型超敏反應是T細胞依賴性反應，其機制是已經致敏的機體（本研究使用50%二硝基氯苯丙酮溶液），再次在抗原的攻擊下可出現遲發型炎癥反應，并通過分光光度計測定遲發型超敏反應OD值判斷遲發型炎癥反應的程度[12-13]。免疫溶血實驗的主要機制是，雞紅細胞致敏小鼠血清中存在IgM，所以致敏小鼠血清再次與雞紅細胞在體外孵育，并在補體（本研究使用豚鼠血清）的參與下發生溶血反應，通過分光光度計測定溶血程度可反映抗體溶血素的水平[14-15]。本研究的結果顯示：與模型組比較，陽性對照組及低、中、高劑量組遲發型超敏反應OD值和血清溶血素OD值均明顯提高，且低、中、高劑量組上述各指標比較差異均有統計學意義。提示鹽酸左旋咪唑可呈劑量依賴性提高小鼠體液免疫和細胞免疫功能。

綜上，鹽酸左旋咪唑呈劑量依賴性提高環磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下，提示其或可治療腫瘤化療或其他疾病導致的免疫功能低下，尚需做進一步研究，全面評價。