HPLC同時(shí)測(cè)定熟肉制品中8種合成著色劑

徐 濱，柳慶坤，徐學(xué)珊*

（1. 泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 泰安 271000；2. 泰安市中心醫(yī)院， 山東 泰安 271000）

常用的食品色素包括兩類(lèi)：天然色素和人工合成著色劑。天然色素主要由植物組織中提取，對(duì)人體無(wú)毒性[1]。人工合成色素多以苯、甲苯、萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)一系列有機(jī)合成反應(yīng)而成，相對(duì)于天然色素，它色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、價(jià)格低廉，成為食品行業(yè)常用的添加劑之一[2-3]。若過(guò)量添加或長(zhǎng)期食用人工合成著色劑對(duì)人體健康會(huì)造成嚴(yán)重危害，嚴(yán)重者甚至?xí)掳⒅禄鸞4]。

目前，測(cè)定人工合成著色劑的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[7]。本文采用HPLC-紫外檢測(cè)器，同時(shí)測(cè)定檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅8種人工合成著色劑。優(yōu)化前處理方法，減少干擾物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大批量、多批次熟肉制品中人工合成著色劑的檢測(cè)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（SPD-20AB型泵、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、LC Solution液相色譜數(shù)據(jù)工作站，日本島津）；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫）；SHIMADZU Wondasil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本島津）；AB104-S電子分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；TG16-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司）；DPS-20均質(zhì)器（美國(guó)PRO）；KQ-600DE型超聲儀（昆山超聲儀器公司）；Essential超純水儀（密理博中國(guó)）；G3垂容漏斗（天津玻璃儀器廠(chǎng)）；50 ml刻度離心管（美國(guó)康寧）；絞肉機(jī)（九陽(yáng)公司）。

1.2 材料

100～200目聚酰胺粉（浙江臺(tái)州路橋四甲生化塑料廠(chǎng)）；0.45 μm微孔濾膜（上海安譜公司）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾公司）；乙酸銨（色譜純，賽默飛世爾公司）；無(wú)水乙醇（分析純，天津百世）；氨水（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；檸檬酸（分析純，天津永大）；甲酸（分析純，成都科龍）；石油醚（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；亞鐵氰化鉀（分析純，天津永大）；乙酸鋅（分析純，天津永大）；純化水。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液見(jiàn)表1。

表1 8種色素對(duì)照品儲(chǔ)備液

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取表1中標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各適量，用水稀釋成濃度分別為 1，5，10，15，20，25 μg/ml的系列混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取熟肉樣品，經(jīng)絞肉機(jī)充分?jǐn)噭颍〖s2.0 g樣品，精密稱(chēng)定，置入50 ml刻度離心管，加溫水約30 ml，均質(zhì)1 min，超聲20 min。加入5 ml亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和5 ml乙酸鋅溶液（183 g/L）溶液，溫水定容至50 ml，充分混勻，靜置10 min。5000 r/min高速離心10 min，取出上層液，加溫水多次提取至無(wú)色，合并上層液于分液漏斗中，加50 ml石油醚萃取3次，取下層液加檸檬酸溶液（0.2 g/ml）調(diào)節(jié)pH 4，作為試樣溶液。取1 g聚酰胺粉加少許水調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液，快速攪拌，如果溶液還有顏色再添加少許聚酰胺粉，至溶液近無(wú)色，用G3垂熔漏斗抽濾，用 pH 4（水加檸檬酸溶液調(diào)pH 4）的水洗3次，每次20 ml，用甲醇-甲酸混合溶液（6:4）洗3次，每次10 ml，再用水洗至中性，用無(wú)水乙醇-氨水-水混合溶液（7:2:1）洗3次，每次5 ml，收集解吸液，加乙酸調(diào)節(jié)pH值至7，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容于5 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙酸銨溶液（0.02 mol/L）為流動(dòng)相，梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣體積為10 μl；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。取混合對(duì)照品溶液10 μl注入高效液相色譜儀，理論板數(shù)以檸檬黃的峰計(jì)算不低于7813，檸檬黃與新紅的分離度大于2。混合對(duì)照品溶液（濃度為15 μg/ml）的色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 混合對(duì)照品溶液的色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍考察 在3.2項(xiàng)色譜條件下，取系列混合對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，得到峰面積（Y）與濃度（X）間的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)各合成著色劑濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性范圍為1～25 μg/ml，相關(guān)系數(shù)r＞0.99994 。

表3 各合成著色劑保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍

2.3.2 檢出限試驗(yàn) 以3倍基線(xiàn)噪音的峰高相當(dāng)?shù)暮铣芍珓┑牧坑?jì)算檢出限，檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅的檢出限分別為0.02，0.028，0.012，0.008，0.016，0.012，0.012，0.008 μg/ml。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取熟肉樣品，加入一定量的混合對(duì)照品溶液，制成模擬陽(yáng)性樣品，進(jìn)樣6次，重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）

2.3.4 回收率試驗(yàn) 取3種已知8種合成著色劑含量的不同熟肉制品各3份，每份2.000 g，分別加入8種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20，40，60 μg，按本法處理，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表5。RSD值在0.32%～2.12%之間，加標(biāo)回收率在83.0%～97.9%之間，符合食品檢驗(yàn)要求。

表5 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 樣品測(cè)定

采用此測(cè)定方法對(duì)110批次的熟肉制品（包括香腸、烤鴨、燒雞、豬頭肉、風(fēng)干肉、肉罐頭等）進(jìn)行了檢測(cè)，部分熟肉制品中檢出了檸檬黃和日落黃，含量分別為3.225 mg/kg、5.165 mg/kg，陽(yáng)性樣品圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 陽(yáng)性樣品溶液色譜圖

3 討論

3.1 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

熟肉制品中含大量蛋白質(zhì)和脂肪，樣品處理中加入蛋白沉淀劑（亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液）去蛋白質(zhì)，用石油醚萃取脂肪，達(dá)到凈化效果，有效減少254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處干擾峰的出現(xiàn)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 色譜柱的選擇

分別用SHIMADZU Wondasil C18-WR和Agilent ZORBAX SB-C18兩種C18柱對(duì)8種混合合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行相同條件的梯度洗脫，由于檸檬黃和新紅兩種合成著色劑的保留時(shí)間非常接近，SHIMADZU Wondasil C18-WR色譜柱不能將兩色譜峰徹底分開(kāi)，合并重疊形成一個(gè)色譜峰。使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，8種合成著色劑分離效果良好，且出峰時(shí)間早，縮短了分析檢測(cè)時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)方法采用梯度洗脫，在254 nm波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定8種合成著色劑，方法穩(wěn)定，線(xiàn)性范圍良好，靈敏度高，受雜質(zhì)峰的干擾較小，各峰之間分離度好，能滿(mǎn)足日常熟肉制品中人工合成著色劑的檢驗(yàn)要求，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。