雞蛋中環丙沙星、恩諾沙星殘留物HPLC-MS/MS分析

唐韻熙，白亞敏，馬雪豐，毛 慶

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院, 重慶 401121）

喹諾酮類藥物（quinolone）是一類較新的廣譜抗菌藥，由于其抗菌力強、口服吸收好，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，已經成為治療細菌感染性疾病的主要藥物[1]。喹諾酮類藥物按其發明先后和抗菌性能的不同，可分為一、二、三、四代，環丙沙星和恩諾沙星均屬于第三代，即在喹諾酮分子的C6位置上引進了氟原子，也稱為氟喹諾酮[1-2]。雖然該類藥物對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有較好的抗菌作用，但也存在嚴重持久性的不良反應，包括肌腱損傷、中樞神經系統紊亂等[3]，也可致癌、致突變、產生過敏反應[4]。隨著我國養殖業的迅速發展，獸藥濫用的情況屢見不鮮，雖然中華人民共和國農業部公告第235號中明確規定，產蛋雞禁用環丙沙星、恩諾沙星[5]，但養殖戶為了提高動物產品產量，將藥物用于飼料添加，或治療家禽疾病，導致了獸藥的殘留，長期使用該超標食品，必定會給人體健康造成傷害。

近期，重慶、江西、海南等多地雞蛋被檢出違禁獸藥殘留，其中環丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考檢出率最多，為了保證人們的健康需求，提高獸藥檢測手段已刻不容緩，目前喹諾酮類藥物的檢測方法主要有酶聯免疫法[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-8]、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS/MS）[9-11]、毛細管電泳法[12]等，相比之下，高效液相與質譜相結合，通過提供精確的母離子和碎片離子的質量數，推算出可能的化合物分子式，從而對化合物結構和裂解規律做進一步確證，這不僅提高了喹諾酮類藥物殘留篩查的可靠性，也提高了方法的靈敏度[13]。

本文以雞蛋為基質，通過酸化乙腈進行前處理，采用HPLC-MS/MS檢測雞蛋中的獸藥殘留物──恩諾沙星、環丙沙星，不僅提高了檢測的檢出限，且對市場上獸藥殘留的監管起到一定的積極作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX API4000+三重四級桿質譜儀（美國AB Sciex公司）；LC-30A型高效液相色譜儀（日本島津）；3-30KS型冷凍離心機（德國Sigma公司）；ML-886渦旋儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造公司）；Turbovap LV全自動濃縮儀（英國 Biotage公司）；IKA T10勻漿機（德國IKA公司）；Milli-q reference 型純水機（美國 Millipore公司）；十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

鹽酸環丙沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 130451-201203）；恩諾沙星對照品（Sigma公司，批號SZBA336XV）；乙腈（美國Fisher公司，色譜純）；甲酸（上海安譜）；正己烷（美國Honeywell公司，色譜純）；實驗用水為自制Milli-q 超純水。

2 方法與結果

2.1 儀器條件

2.1.1 HPLC條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣量：1 μl；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%B～40%B，1.5～1.6 min，40%B，1.6～3.6 min，40%B～90%B，3.6～5 min，90%B，5～5.1 min，90%B～10%B，5.1～8 min，10%B，流速為0.3 ml/min。

2.1.2 MS條件 ESI正離子模式；離子源電壓：5500 V；氣簾氣流量：25 psi；離子源溫度：500 ℃；輔助加熱氣（氮氣）流量：55 psi；霧化氣流量：55 psi；采集數據方式：多反應監測（MRM）。其他質譜條件見表1。

表1 環丙沙星、恩諾沙星LC-MS/MS MRM參數

2.2 溶液的配制

2.2.1 單一對照品儲備液的制備 分別準確稱取鹽酸環丙沙星對照品11.53 mg、恩諾沙星標準品10.88 mg，用乙腈定容至10 ml,使其濃度分別為1.039 mg/ml、1.077 mg/ml，將配置好的儲備液置于4 ℃冰箱中冷藏。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密準確移取0.25 ml環丙沙星對照品儲備液、0.10 ml恩諾沙星對照品儲備液，置入10 ml量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成環丙沙星濃度25.97 μg/ml、恩諾沙星濃度10.77 μg/ml混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱中冷藏。使用時根據需要配制成相應濃度的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取混合均勻的蛋清蛋黃混合物5 g，于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 ml 2%甲酸乙腈溶液，用勻漿機均質1 min，9000 r/min離心10 min。取上清于40 ℃下氮氣吹干，加入1.0 ml 0.1%甲酸水溶液溶解殘渣，再用2 ml乙腈飽和的正己烷去除脂肪，直至下層溶液澄清為止。下層水相過0.22 μm濾膜，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 取經過確證不含恩諾沙星和環丙沙星的混合均勻的蛋清蛋黃混合物5 g，按2.2.3供試品溶液的制備方法，制得陰性供試品溶液。

陰性供試品溶液、環丙沙星和恩諾沙星對照品溶液與供試品溶液的總離子流對比圖見圖1。

圖1 陰性供試品溶液、環丙沙星和恩諾沙星對照品溶液與供試品溶液的總離子流圖

2.3 方法學考察

2.3.1 定量限及線性關系試驗 用陰性供試品溶液將2.2.2中環丙沙星、恩諾沙星混合標準工作溶液配制成系列濃度的標準溶液。在陰性供試品溶液中添加適當濃度的環丙沙星、恩諾沙星標準溶液，使得樣品處理后儀器信噪比（S/N）≥10，從而確定儀器定量限；以目標物的質量濃度為橫坐標（X，ng/ml），目標物分子離子峰的峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得到的線性關系良好，見表2。

表2 線性關系、相關系數、儀器定量限

2.3.2 回收率試驗 在未檢出環丙沙星和恩諾沙星的雞蛋樣品中分別添加環丙沙星含量1.0388，2.597 μg/kg，恩諾沙星含量0.4308，1.07μg/kg的混合對照品溶液，按本方法測定，計算回收率及相對標準偏差（RSD）。結果環丙沙星和恩諾沙星的回收率分別為90.7%～107.6%和80.1%～101.6%、85.0%～105.4%和86.9%～103.6%，RSD分別為6.0%，10.1%和8.7%，8.5%。

2.4 樣品測定

利用本文建立的分析方法，對市場上近100批雞蛋進行了測定。其中有6批為陽性樣品，環丙沙星的檢出含量為10.68～63 μg/kg，恩諾沙星的檢出含量為2.36～7.13 μg/kg。

3 討論

3.1 前處理方法的選擇

喹諾酮屬于高極性化合物，可溶于極性有機溶劑，而不溶于非極性溶劑，常采用的提取溶劑有乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、酸堿性水溶液等，由于雞蛋中含較多的蛋白質和脂肪，在提取樣品時考慮采用酸化乙腈為溶劑除蛋白，采用正己烷對提取液脫脂。有研究表明，酸化乙腈對喹諾酮的提取率有提高作用[14]。

3.2 液相色譜條件的優化

選用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水為流動相，通過調節有機相與水相的比例，從而優化色譜條件；在流動相中加入甲酸也可在一定程度上提高檢測的靈敏度及待測物的離子化效率。

3.3 質譜條件的優化

3.3.1 定量、定性離子的選擇 在ESI正離子模式下對環丙沙星和恩諾沙星結構進行電離，針泵連續進樣，對環丙沙星和恩諾沙星混合對照品溶液（50 ng/ml）進行一級質譜掃描，確定其母離子。再對確定的母離子進行二級質譜掃描，通過優化去簇電壓和碰撞能而使其子離子有較強的離子強度，經優化后的環丙沙星和恩諾沙星質譜參數見表1。

3.3.2 環丙沙星和恩諾沙星的子離子產生途徑 在正離子模式下，環丙沙星和恩諾沙星易分別形成分子離子峰[M+H]+m/z332.2和m/z360.3，兩個分子離子峰易失去CO2后產生碎片離子m/z288.2和m/z316.3，m/z288.2和m/z316.3再經過兩次四元環氫重排后得到m/z245.1和m/z245.3[14]。

4 結論

本文建立了用于檢測雞蛋中環丙沙星和恩諾沙星殘留量的HPLC-MS/MS方法。該方法前處理過程較為簡單，通過色譜及質譜條件的優化，提高了方法的靈敏度，同時，在試驗線性范圍內，線性關系、回收率較好，分析時間短，為環丙沙星、恩諾沙星殘留的快速檢測提供了可靠方法。