反相高效液相色譜法測定不同產地憂遁草中夏佛塔苷的含量

劉 夢，林 強

（北京聯合大學，北京 100191）

憂遁草為爵床科（Acanthaceae）鱷嘴花屬鱷嘴花Clinacanthus nutans(Burm. F.) Lindau 的全草。別名千里追、柔刺草、漢帝草、沙巴蛇草，印尼民眾稱之為Sambung nyawa。主要分布于中南半島、馬來半島以及我國的南部和西南部。有報道稱2011年因馬來西亞某癌癥患者服用憂遁草后康復，于是憂遁草的藥用價值獲得關注。研究表明，憂遁草有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調節的生物活性[1-4]，其中黃酮碳苷類物質有降血糖、防輻射、抗菌殺蟲、抗病毒及對肝臟心腦血管的保護多種生理活性[5]。黃丹民[6]研究憂遁草中黃酮碳苷類化合物發現，夏佛塔苷是憂遁草中含量最高的黃酮類化合物，并將其含量作為憂遁草質量控制的指標。人工種植的憂遁草由于環境和氣候變化，其主要成分將有較大變化。本文檢測國產和印度尼西亞兩種憂遁草中夏佛塔苷含量，以此為中藥和保健食品開發選材及不同地區選材標準的制定奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），Adventurer AR1140電子天平（奧豪斯，精密度萬分之一），Christ Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機（德國CHRIST公司），Rotavapor R215旋轉蒸發儀（瑞士BUCH公司I），KH-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，色譜醇、雙蒸水均經0.45 μm濾膜過濾。夏佛塔苷對照品（livingbio，批號：170413，純度≥98%），憂遁草樣品（中國海南人工種植，印度尼西亞巴芝丹人工種植）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 取10 mg夏佛塔苷對照品，用50%甲醇溶解定容至25 ml量瓶，配成0.4 mg/ml夏佛塔苷對照品溶液，用0.45 μm濾膜過濾備用。

圖1 對照品和供試品色譜圖

2.1.2 供試品溶液 取國產憂遁草、印度尼西亞憂遁草各3 g，分別用60 ml 50%甲醇溶解，超聲提取30 min，旋蒸濃縮，凍干稱重。取適量的凍干粉末溶于2 ml 50%甲醇溶液，用0.45 μm濾膜過濾備用。

2.2 色譜條件

采用Diamonsil C18(2)色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A相為0.1%乙酸水溶液，B相為甲醇，等度洗脫：0～60 min 24% B，流速1 ml/min, 柱溫30 ℃，檢測波長272 nm。在上述色譜條件下對照品及供試品的色譜圖見圖1（橫坐標為出峰時間，縱坐標為吸光度）。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液15，20，25，30，35，40 μl，按上述條件分別注入液相色譜儀測定，以夏佛塔苷含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y= 1 874 481X– 635 065，R2=1 。結果表明，夏佛塔苷在5.88～15.68 μg范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液25 μl，連續進樣6次，測得夏佛塔苷的峰面積RSD為0.26%，結果表明，進樣精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密稱取國產憂遁草提取物0.0148 g，用2 ml 50%甲醇溶解，濾膜過濾，分別在室溫放置0，2，4，8，12，16，24 h，進樣測定夏佛塔苷峰面積。峰面積RSD為1.49%。結果表明，供試品溶液室溫放置24 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取適量國產憂遁草提取物6份，用2 ml 50%甲醇溶解，濾膜過濾，在上述色譜條件下進樣25 μl，測定夏佛塔苷含量，結果表明，夏佛塔苷平均含量為9.99 mg/g，其RSD為0.13%。

2.7 加樣回收試驗

取6份已知含量的國產憂遁草提取物，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（濃度為0.4 mg/ml）2 ml，按2.2項下方法，依次測定夏佛塔苷的含量，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.8 樣品測定

取國產憂遁草和印度尼西亞憂遁草提取物適量，用50%甲醇溶解，用濾膜過濾，制備2份供試品溶液，按2.2項下方法，依次測定夏佛塔苷的含量，采用外標法計算。結果見表2。

表2 樣品中夏佛塔苷含量的測定結果（n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇

比較甲醇-水、乙腈-水等流動相。結果表明，甲醇-水系統對憂遁草樣品的分離效果最好，甲醇-水系統夏佛塔苷峰拖尾嚴重，峰型差，可能因為夏佛塔苷結構中含有較多的醇羥基和酚羥基，羥基電離影響了分離效果，加入乙酸起到離子對抑制作用，峰型較優[7]。通過等度洗脫和梯度洗脫的比較發現等度洗脫可以使憂遁草樣品達到較好的分離效果，經過多次嘗試，最后選用等度洗脫。

3.2 波長的選擇

對夏佛塔苷對照品溶液掃描，發現其最大吸收波長在270 nm附近，參照《中國藥典》（2015年版）廣金錢草中夏佛塔苷的檢測波長[8]，最后選擇272 nm作為檢測波長。

3.3 提取溶劑的選擇

參考夏佛塔苷測定的文獻[9]，考察40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇提取效率，結果表明，50%和60%甲醇明顯優于40%甲醇，綜合考慮經濟成本及毒性，最后選用50%甲醇提取。

4 結論

結果表明，國產憂遁草中夏佛塔苷的含量明顯地高于印度尼西亞產的憂遁草。夏佛塔苷作為一種已知的含量最多黃酮碳苷類化合物，其含量的高低直接影響到憂遁草的功效。但憂遁草中黃酮種類較多，其他黃酮成分的含量與功效還有待進一步研究。有研究對馬來西亞Negeri Sembilan，Johor和Perak三個地區的憂遁草中四種黃酮碳苷類化合物的含量[10]，其中夏佛塔苷的含量均低于國產憂遁草，國產和印尼憂遁草的功效高低還需進一步研究。