鳶尾異黃酮的分離純化及抑菌活性研究

趙華龍，毛 涵,2，王遠平，王 露，湯新慧*

（1. 鹽城師范學院 江蘇省灘涂生物資源與環境保護重點建設實驗室, 江蘇 鹽城 224051；2. 南京工業大學 生物與制藥工程學院, 江蘇 南京 210009）

鳶尾（Iris tectorumMaxim）是一種傳統的藥用植物，屬天門冬目，鳶尾科多年生草本，味苦、辛，性冷，有小毒，多生長于坡地、林緣及水邊濕地，喜陽光充足的環境[1]。鳶尾的藥用歷史久遠，《中華本草》記載[2]，鳶尾具有清熱解毒、祛風利濕、消腫止痛等功效，可用于治療跌打損傷、風濕疼痛、咽喉腫痛、食積腹脹、瘧疾等病癥，也可外用治癰癤腫毒、外傷出血。從鳶尾中分離出的多種天然產物中，黃酮類為其主要的化學成分。研究表明，鳶尾中發揮功效的主要有效成分為異黃酮[3]。鳶尾中含有豐富的異黃酮類，主要包括野鳶尾苷元、鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素等[4]，有廣泛的生物活性。近年，對于鳶尾屬植物中黃酮類成分的研究多集中于成分結構及生物活性，全新的化合物和多樣的生物活性不斷被發現，其中擁有多種生理功能的異黃酮日益受到關注。Xie等[5]從屋頂鳶尾中分離出2種新的異黃酮類化合物Iriskashmirianin A和Germanaism H，并發現其能抑制埃利希腹水癌（EAC）細胞系增殖，有顯著的抗炎作用。Fang等[6]從鳶尾中分離出的異黃酮成分 Iritectol B和Iridobelamal A對人乳腺癌細胞（MCF7）和人惡性黑色素瘤細胞（C32）呈現出明顯的細胞毒性，顯示其一定的抗癌作用。Kang等[7]研究表明，鳶尾黃素 （tectorigenin）能通過激活ERK信號通路清除細胞內的活性氧和DPPH自由基，以防止脂質過氧化。然而目前對于鳶尾異黃酮是否具有抗菌作用鮮有報道。

鳶尾異黃酮的提取多集中于根莖，鳶尾葉中也含有豐富的異黃酮成分，開發鳶尾葉的價值有助于鳶尾的充分利用。本實驗以鳶尾葉為原料，以醇提法提取鳶尾葉中的總黃酮，采用硅膠柱色譜結合高效液相色譜法對鳶尾異黃酮進行分離純化和含量測定[8]，確定鳶尾異黃酮的最佳分離純化工藝及含量測定條件，并考察鳶尾異黃酮體外抗菌活性，以期為鳶尾藥用價值的進一步開發利用提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

野生鳶尾，采集于江蘇省鹽城市沿海灘涂，經鹽城師范學院海洋與生物工程學院孫同興教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬鳶尾（Iris tectorumMaxim.）全草；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（江蘇省康華醫藥科技實業中心）；鳶尾苷對照品（純度≥98%，德思特生物）；硅膠（試劑級，300～400目，煙臺新諾）；甲醇：色譜純，其他試劑均為分析純。

UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；IKA RV 10旋轉蒸發儀（艾卡儀器設備）；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生）； UV-2000紫外分析儀（上海嘉鵬科技）；KQ-100DB數控超聲波提取儀（昆山超聲儀器）。

1.2 鳶尾異黃酮制備方法

鳶尾葉洗凈，干燥，打磨成粉，稱取鳶尾葉干粉10 g，以料液比1:25加入85%乙醇溶液溶解，置于超聲波提取儀超聲50 min，功率90 W。重復提取3次，抽濾，合并濾液。真空濃縮至約350 ml，加入等體積石油醚萃取，至石油醚無色，合并萃取液，繼續真空濃縮至浸膏，移入冷凍干燥機內凍干，稱重，得鳶尾異黃酮粗提物[9]。

1.3 鳶尾異黃酮分離純化方法

1.3.1 柱層析洗脫劑的選擇 以85%乙醇為溶劑[10]，將粗提物干粉定容至10 ml，混勻，制備鳶尾黃酮粗品醇溶液。分別以85%乙醇、乙酸乙酯-丙酮-無水乙醇（5:1:0.5）和乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5:2:1）為展開劑在硅膠G板上定距8 cm展開，以鳶尾苷作為對照品，265 nm波長紫外分析儀下顯色，觀察展開效果，選擇合適洗脫劑。

1.3.2 硅膠柱層析分離純化 采用濕法裝柱，稱取硅膠粉末20 g，洗脫劑浸泡30 min。取直徑2.5 cm，柱長40 cm層析柱豎直固定，關閉底部活塞，將硅膠沿玻璃棒裝入層析柱內，待硅膠自然沉降，排出洗脫劑，輕輕敲打柱壁使硅膠沉積壓實。取1 ml樣品溶液，沿層析柱內壁緩慢均勻加入，樣品層上加一層脫脂棉輕輕壓實。洗脫劑進行洗脫，每10 ml收集一份，依次編號。薄層層析（TLC）法檢測收集的各管洗脫液，合并含鳶尾異黃酮的洗脫液。

1.4 鳶尾異黃酮含量和純度測定

1.4.1 HPLC色譜條件 取適量鳶尾苷對照品和鳶尾異黃酮樣品用色譜甲醇定容至10 ml，0.45 μm微孔濾膜過濾制得對照品和樣品溶液。使用C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，B為0.4%磷酸，以A:B = 90:10（v/v）進行洗脫，流速1 ml/min，進樣量20 μl，檢測波長為265 nm。

1.4.2 標準曲線制作 取鳶尾苷對照品溶液20 μl 進行HPLC分析，記錄峰面積，以對照品濃度（X，mg/L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.5 鳶尾異黃酮抑菌試驗

精密稱取純化后的鳶尾異黃酮配制濃度為0.625，1.25，2.5，5 mg/ml的樣品溶液。分別以大腸桿菌和枯草芽孢桿菌作為指示菌，制備指示菌菌液，各吸取200 μl加至LB培養基平板涂布均勻，含菌濃度約l06cfu/ml。在平板上放置牛津杯，分別加入各組樣品100 μl，空白樣品作為對照，置于37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑[11]，每組設置3個平行實驗。

2 結果與分析

2.1 樣品分離純化

根據鳶尾異黃酮易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸等有機溶劑的極性，配制合適比例的洗脫劑。鳶尾異黃酮的化學結構是以3-苯基苯并吡喃酮為母體的多羥基酚類，與雌二醇結構相似，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等極性溶劑，基本不溶于水[12]。故分別設置85%乙醇（洗脫劑I）、乙酸乙酯:丙酮:無水乙醇=5:1:0.5（v/v/v）（洗脫劑II）、乙酸乙酯:甲醇:甲酸=5:2:1（v/v/v）（洗脫劑III），TLC法對鳶尾異黃酮粗品溶液進行展開分析。結果表明，洗脫劑I展開拖尾現象較嚴重，且各組分不能充分展開。洗脫劑II和洗脫劑III（圖1 A）對鳶尾異黃酮均有一定展開效果，且展開的各組分中有與對照品處于同一位置的斑點；其中洗脫劑II的展開效果較好，各條帶分離較明顯，故作為柱層析洗脫劑對鳶尾異黃酮進行分離純化。

圖1 鳶尾異黃酮薄層色譜圖

以洗脫劑II對鳶尾總黃酮進行洗脫，洗脫組分分別用25 ml錐形瓶收集，每瓶10 ml，依次編號。洗脫結束后取1，2，4，7，9，11，13，15，17，19，22，24，26，29，31，34，37，40號收集液進行TLC分析，結果表明，4～19號收集液的薄層層析斑點與對照品斑點處于同一位置（圖1B），合并與對照品斑點處于同一位置的收集液，真空濃縮至干，稱重。

2.2 樣品含量及純度測定

2.2.1 線性關系考察 精密稱取2 mg鳶尾苷對照品溶于20 ml 70%乙醇溶液，分別取0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9，1.0 ml定容至10 ml，搖勻，配制成系列濃度對照品溶液。以70%乙醇溶液為空白對照，在波長265 nm處測定吸光值，以鳶尾苷濃度為橫坐標，各濃度吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得直線回歸方程Y=1.5855X+0.0141，R2=0.9794，RSD=1.05%（n=5），表明鳶尾苷濃度在1～100 μg/ml范圍內呈良好線性關系。

圖2 鳶尾異黃酮HPLC色譜圖

2.2.2 樣品制備與測定 采用面積歸一化法，測定鳶尾苷對照品的純度。精密稱取鳶尾苷對照品，用色譜甲醇配制濃度為0.1 mg/ml樣品溶液，根據實驗方法1.4.1中的HPLC色譜條件分析，結果表明，對照品為單峰（圖2A），保留時間為1.53 min，用面積歸一化法計算含量為99.76%，符合對照品含量測定使用要求。樣品HPLC分析結果顯示為單峰，保留時間1.55 min，與對照品基本一致（圖2B）。根據HPLC測定結果，計算樣品中鳶尾異黃酮的含量和純度。

結果見表1，鳶尾異黃酮在總黃酮粗提物中的含量為620 mg/ml，純度為15.28%，得率6.09%。純化后的鳶尾異黃酮含量為167.4 mg/ml，純度為91.29%，得率1.62%。

表1 鳶尾異黃酮含量和純度

2.3 抗菌活性

分別以革蘭陽性菌枯草芽孢桿菌和革蘭陰性菌大腸桿菌為指示菌，檢測不同濃度鳶尾異黃酮的抗菌活性。結果見表2。不同濃度的鳶尾異黃酮對枯草芽孢桿菌均有一定抑菌效果，而0.625 mg/ml鳶尾異黃酮對大腸桿菌無抑菌作用，隨著濃度增加，開始顯示出一定的抑菌效果。

表2 牛津杯法實驗結果

檢測各處理組的抑菌圈直徑，結果見表3。鳶尾異黃酮對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有一定程度抑制作用。鳶尾異黃酮對大腸桿菌最小抑菌濃度為1.25 mg/ml，對枯草芽孢桿菌最小抑菌濃度為0.625 mg/ml。

表3 不同濃度鳶尾異黃酮對不同菌種的抑制作用

3 討論

異黃酮是一種弱的植物雌激素，其化學結構中B環連接于C3位上，分子間的作用力較大，導致脂溶性和水溶性較差，只能溶于一些有機試劑[15-17]。根據鳶尾異黃酮的這種結構特性，筆者分別嘗試以不同比例的85%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、甲醇、甲酸等成分配制柱層析洗脫劑，發現以乙酸乙酯:丙酮:無水乙醇= 5:1:0.5（v/v/v）為洗脫劑分離效果最佳，其他條件均會出現分離不充分或不同程度的拖尾現象。在HPLC檢測含量過程中，也探索了流動相。鳶尾中所含成分比較復雜，雖經柱層析分離各成分，但也有可能仍有雜質未充分分離，流動相不合適易造成出峰時間過長或分離效果不佳。筆者通過調節甲醇與0.4%磷酸比例，分別設置甲醇:0.4%磷酸比例50:50（v/v）、70:30（v/v）、80:20（v/v）、90:10（v/v）為流動相對樣品進行梯度洗脫。結果表明，以甲醇:0.4%磷酸=90:10（v/v）為HPLC流動相，樣品和對照品的峰型均為單峰，保留時間較為一致，分離效果較好。

藥物濃度是影響抑菌效果的重要因素之一。對半稀釋鳶尾異黃酮溶液建立濃度梯度樣品溶液，實驗過程中發現，在0.625～5 mg/ml范圍內，隨著濃度的增加，鳶尾異黃酮分別對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌呈現出一定的抑制效果，當樣品濃度大于5 mg/ml時，各濃度的抑菌圈之間會形成交叉，影響試驗結果的統計。而濃度小于0.625 mg/ml時，各抑菌圈之間并未呈現明顯的差異。同時，鳶尾異黃酮表現出對枯草芽孢桿菌更明顯的抑制作用，顯示其對革蘭陽性菌具有較為突出的抑菌效果。

綜上所述，本研究通過柱層析-高效液相色譜法得到純度較高的鳶尾異黃酮，通過抑菌試驗證實其具有顯著的抑菌活性，對于深入推廣和研究鳶尾的藥理作用具有一定的參考價值。