破壁靈芝孢子粉對環磷酰胺致小鼠免疫抑制的調節作用

張 雯，宋俊科，王海港，周啟蒙，王曉波，杜冠華

（中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 藥物研究所，北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室，北京100050）

靈芝是一種傳統名貴藥材，也是可食用真菌，具有安神益氣、活血益筋、止咳平喘、扶正固本等功效。靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的細小顆粒，富含人體必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物堿和三萜類等物質，具有抗腫瘤、免疫調節和保肝降糖等多種功能[1-2]。靈芝孢子有兩層質地堅硬、耐酸的孢壁，阻礙機體的消化吸收，因此靈芝孢子需破壁服用[3-4]。

靈芝對免疫力的調節作用已有報道，但對破壁前后靈芝孢子粉的作用差異尚缺乏充分的認識。環磷酰胺（cyclophosphamide）是醫學上常用的抗癌藥，也是常用的免疫抑制劑，可用于建立免疫低下的動物模型[5-6]。本實驗應用高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）測定破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、和D的含量，以環磷酰胺免疫低下小鼠作為模型動物，考察破壁機處理靈芝孢子粉對環磷酰胺所致免疫抑制的調節作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JYL-Y8 PLUS營養破壁調理機（九陽）；JYL-C051料理機（九陽）；Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6110單四級桿質譜儀（美國Agilent）；CascadaTMLS water純水儀（美國Pall）；Spectra Max M5酶標儀（美國Molecular Devices）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）；XS105 DU電子天平（瑞士Mettler Toledo）；Vortex Genie 2渦旋震蕩儀（美國Scientific Industries）；MiniSpin常溫離心機（德國Eppendorf）。

1.2 材料

靈芝孢子粉（北京協和藥廠）；環磷酰胺（山西普德藥業）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的CD3+（FITCCD3+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的CD8+（PE-CD8+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-菁類染料（cyanine，Cy5）偶聯標記的CD4+（PE-CY5-CD4+）（美國BD）；RPMI-1640細胞培養液，胎牛血清（美國Gibco）；紅細胞裂解液（碧云天）；噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美國Sigma Aldrich）；小鼠免疫球蛋白IgG、IgM ELISA試劑盒（武漢華美）。

1.3 動物

KM小鼠（SPF級），雄性，30～32 g[北京斯貝福實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002]。飼養于中國醫學科學院藥物研究所實驗動物中心（No. 00000804），自由攝食飲水，室溫22±1 ℃，相對濕度55～65%，12 h光照周期。所有動物的飼養和實驗過程均按照中國醫學科學院藥物研究所實驗動物倫理委員會的指導方針。

2 方法

2.1 靈芝孢子粉處理

準確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用破壁調理機處理，轉速10級，時間20 s/次，共4次。準確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用料理機處理，默認轉速，時間20 s/次，共4次。分別得破壁靈芝孢子粉混懸液和非破壁靈芝孢子粉混懸液。

2.2 破壁與非破壁靈芝孢子粉離心后沉淀重量比較

離心管稱重，分別加入破壁及非破壁處理的靈芝孢子粉混懸液5 ml，稱重，1000 r/min離心10 min，棄上清，再次稱重，計算沉淀重量。

2.3 化合物檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃，進樣量10 μl，檢測波長288 nm，流動相為0.02%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用負離子檢測模式，分別采用全掃描模式和單離子監測模式對潛在化合物靈芝酸A、C2、D進行預測。

質譜檢測參數為碎裂電壓150 V，增益1.5，干燥氣流速度10.0 L/min，噴霧氣壓力35 psig，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓 3000 V（正模式），3000 V（負模式）。單離子監測模式監測的m/z見表2。

表2 單離子監測模式檢測的離子m/z和對應的目標化合物

2.4 模型制備及分組

昆明小鼠80只，隨機分為正常對照組、模型組、非破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）和破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）。除正常對照組外其余3組腹腔注射環磷酰胺80 mg/kg，連續注射3 d。從第4天起開始給藥，各給藥組每天灌胃給予相應的藥物溶液，10 ml/kg，每天1次，連續28 d。正常對照組和模型組給予等容積的滅菌水。

2.5 自主活動測定

將小鼠放入自主活動箱中，測定前每只小鼠先適應環境1 min，再由記錄儀自動記錄3 min內小鼠自發活動次數。

2.6 免疫球蛋白及T細胞亞群測定

采用ELISA法測定血清IgG和IgM水平。每只小鼠取全血樣50 μl，加入紅細胞裂解液500 μl，然后輕輕吹打均勻，2 min后800 r/min離心5 min，棄去上層紅色液體，離心洗滌兩次。加入50 μl生理鹽水重懸后分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體各1 μl，室溫下避光靜置15 min，加入450 μl生理鹽水輕吹混勻，上流式細胞儀檢測。

2.7 骨髓有核細胞計數測定

取小鼠一側完整股骨，除凈軟組織，用PBS將全部骨髓沖洗至離心管，過200目細胞篩，定容至5 ml。計數板計數，并計算絕對數量[7]。

2.8 免疫器官指數及淋巴細胞增殖的測定

無菌取脾和胸腺，清洗血跡并吸干水分，稱重，計算臟器指數。置于2 ml RPMI-1640細胞培養液中，200目細胞篩中研磨，收集細胞，后加入10 ml PBS，1000 r/min離心10 min，重復兩次。棄去上層溶液，加入6 ml紅細胞裂解液，吹打均勻，1500 r/min離心10 min，棄去上層溶液。加3 ml RPMI-1640細胞培養液，吹打均勻。以含10% FBS的RPMI-1640培養液調整細胞濃度為1×106個/ml，鋪96孔板。設置加刺激組和對照組，刺激組加入ConA（終濃度為5 μg/ml）或LPS（終濃度為10 μg/ml），對照組加入等體積RPMI-1640細胞培養液。48 h后MTT染色，計算T淋巴細胞和B淋巴細胞相對增殖指數。

2.9 數據統計處理

3 結果

3.1 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉離心后沉淀物重量比較

破壁靈芝孢子粉的沉淀重量較不破壁靈芝孢子粉的沉淀重量輕（P＜0.05），表明經破壁處理的靈芝孢子粉有更多物質混懸到溶液中，導致其沉淀重量較輕，見表3。

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

注：*P＜0.05 vs 非破壁組

非破壁/mg 破壁/mg 1180.7±141.1 1012.7±59.6*

3.2 HPLC-MS比較破壁與非破壁靈芝孢子粉中化合物含量差別

結果見表4。由表4可見，破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D的釋放量顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的釋放量（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對含量比較（±s，n=6）

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對含量比較（±s，n=6）

注：***P＜0.001 vs 非破壁組

非破壁組相對含量/% 破壁組相對含量/%靈芝酸A 98.41±4.96 116.54±3.47***靈芝酸C2 97.70±5.92 110.13±10.34***靈芝酸D 103.44±7.55 117.76±2.25***

3.3 靈芝孢子粉對小鼠存活率的影響

連續統計31 d內各組小鼠死亡情況，模型動物死亡率為35%（7/20），非破壁靈芝孢子粉治療組動物死亡率為25%（5/20），破壁靈芝孢子粉治療組動物死亡率為20%（4/20），破壁與非破壁靈芝孢子粉組動物死亡率差異無統計學意義。

3.4 靈芝孢子粉對小鼠自主活動的影響

測定各組小鼠自主活動次數，結果見圖1，各組間差異無統計學意義。

圖1 小鼠自主活動次數（n=10）

3.5 靈芝孢子粉對小鼠胸腺、脾臟指數的影響

結果見表5。由表5可見，與正常組相比，模型組小鼠胸腺、脾萎縮變小，胸腺指數和脾指數均顯著降低（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數顯著升高（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數與模型組相比，差異無統計學意義。說明破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數，非破壁給藥組無此作用。兩個給藥治療組脾指數均有升高趨勢，但差異無統計學意義。

表5 胸腺、脾臟指數（±s，n=6）

表5 胸腺、脾臟指數（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；**P＜0.01 vs 模型組

胸腺指數 脾指數對照組 1.49±0.42 5.12±0.76模型組 0.66±0.27### 3.54±0.88###非破壁組（750 mg/kg） 0.89±0.29 3.71±0.56破壁組（750 mg/kg） 1.05±0.34** 3.94±0.86

3.6 破壁靈芝孢子粉增加小鼠骨髓有核細胞

結果見表6。由表6可見，與對照組比較，模型組股骨有核細胞絕對數值顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高股骨有核細胞絕對數值（P＜0.05）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對骨髓有核細胞數無顯著影響。說明破壁靈芝孢子粉的治療作用優于非破壁靈芝孢子粉。

表6 骨髓有核細胞絕對數值（ ±s，n=6）

表6 骨髓有核細胞絕對數值（ ±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05 vs 模型組

骨髓有核細胞數（×106）對照組 13.18±1.81模型組 6.8±1.35###非破壁組（750 mg/kg） 8.57±0.86破壁組（750 mg/kg） 9.17±1.23*

3.7 靈芝孢子粉對小鼠淋巴細胞增殖的作用

結果見表7。由表7可見，與正常組相比，模型組的刺激指數均顯著降低（P＜ 0.001），即腹腔注射環磷酰胺能顯著抑制機體T、B淋巴細胞的增殖。與模型組相比，破壁與非破壁靈芝孢子粉治療均能顯著提高T淋巴細胞的增殖指數（P＜0.05，P＜0.05）。破壁靈芝孢子粉能顯著提高B淋巴細胞的增殖指數（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對B淋巴細胞增殖指數無顯著影響。

表7 淋巴細胞增殖指數（±s，n=6）

表7 淋巴細胞增殖指數（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

T淋巴細胞增殖指數 B淋巴細胞增殖指數對照組 0.8±0.09 0.38±0.03模型組 0.31±0.05### 0.1±0.03###非破壁組（750 mg/kg） 0.46±0.09* 0.15±0.03破壁組（750 mg/kg） 0.47±0.08* 0.19±0.06**

3.8 破壁靈芝孢子粉調節外周血中T細胞亞群

結果見表8。由表8可見，與正常對照組相比，環磷酰胺可顯著下調CD3+和CD4+T細胞亞群的比例（P＜0.001，P＜0.01），降低CD4+/CD8+T細胞比值（P＜0.001），上調CD8+T細胞亞群的比例（P＜0.01）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著抑制CD3+、CD4+的降低（P＜0.001，P＜0.01），顯著降低環磷酰胺所致CD8+（P＜0.01）的升高，調節CD4+/CD8+T細胞比值（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥組CD3+的比例和CD4+/CD8+的比值均顯著低于破壁處理組（P＜0.01，P＜0.05）。

表8 外周血中T細胞亞群（ ±s，n=6）

表8 外周血中T細胞亞群（ ±s，n=6）

注：##P＜0.01，###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs 模型組；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs 破壁組

CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對照組 72.19±5.23 64.52±5.06 19.77±1.01 3.26±0.90模型組 53.52±4.49### 43.39±5.50## 30.41±2.00## 1.44±0.48###非破壁組（750 mg/kg） 56.83±4.04&& 50.87±6.73 26.15±3.56 1.95±0.52&破壁組（750 mg/kg） 66.13±4.25*** 61.32±3.59** 21.78±1.74** 2.83±0.24**

3.9 破壁靈芝孢子粉增加血清中IgG和IgM的含量

結果見表9。由表9可見，環磷酰胺模型組小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平均顯著低于對照組（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉能提高小鼠血清中IgM的含量（P＜0.05），對小鼠血清中IgG含量沒有明顯影響。破壁靈芝孢子粉治療組能顯著提高IgG（P＜0.05）和IgM（P＜0.01）的水平。

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

IgG IgM對照組 1297.5±236.18 615.67±35.46模型組 602.33±244.57###309.67±64.49###非破壁組（750 mg/kg） 882.8±128.2 414.27±65.05*破壁組（750 mg/kg） 925.19±93.35* 468.49±80.16**

4 討論與結論

靈芝孢子有兩層耐酸堿的堅硬壁狀結構，只有經過破壁的靈芝孢子才利于人體吸收利用，發揮其藥理活性，尤其是免疫活性[3-4]。靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均是三萜類物質，是靈芝中的主要活性化合物。但靈芝孢子的破壁目前除了工業化處理外，尚沒有簡易的方法，使靈芝孢子的應用受到限制，也導致大量靈芝孢子雖被使用，但沒有發揮相應作用。

本實驗結果表明，應用破壁機，可實現對靈芝孢子的破壁，使其釋放更多的營養物質，其中破壁靈芝孢子粉中的靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的對應物質。

免疫是指機體免疫系統識別自身與異己物質，并通過免疫應答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能[8-9]。目前，人們普遍認為機體的健康狀況及壽命的長短與免疫功能息息相關。當機體免疫功能下降或受抑制時，不能有效地識別并清除突變的細胞及外來細菌、病毒等，腫瘤及感染性疾病發生率增高[10-12]。因此，提高自身免疫力成了人們關注的話題，開發安全的具有免疫增強作用的功能性食品成為研究熱點[13-16]。

環磷酰胺是較強的烷化劑，可引起骨髓造血抑制和免疫抑制。實驗小鼠腹腔注射80 mg/kg環磷酰胺后，小鼠存活率顯著降低，免疫器官萎縮變小，股骨有核細胞絕對數值顯著降低，脾臟、胸腺的T、B淋巴細胞活性均受到不同程度抑制，且免疫球蛋白IgG和IgM含量降低。由此可見應用環磷酰胺腹腔注射小鼠造成免疫功能低下模型，可用來觀察不同破壁模式下靈芝孢子粉對免疫功能的影響。

連續28 d分別灌胃給予兩組實驗小鼠破壁靈芝孢子粉和非破壁靈芝孢子粉（750 mg/kg）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組能提高小鼠存活率，顯著提高小鼠胸腺指數，股骨有核細胞絕對數值顯著升高，且能顯著抑制環磷酰胺導致的T淋巴細胞及B淋巴細胞增殖轉化率的降低，顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉給藥治療對小鼠胸腺指數、脾指數、股骨有核細胞數、B淋巴細胞增殖轉化率、免疫球蛋白IgG均無顯著影響，僅能有效抑制環磷酰胺導致的T淋巴細胞增殖轉化率的降低、顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgM水平。

T淋巴細胞主要介導細胞免疫，在體內參與特異性免疫，它不僅是細胞免疫功能的承擔者，也是免疫應答的調節者。其中CD3+包括外周所有成熟T細胞，代表細胞免疫的總體水平[12,17]。CD4+細胞代表輔助/誘導性T細胞（Th），CD8+細胞代表抑制/殺傷性T細胞（Ts），二者在體內維持一定的比例，共同參與免疫應答過程。本實驗中，磷酰胺可顯著下調CD3+和CD4+T細胞亞群的比例，降低CD4+/CD8+T細胞比值，上調CD8+T細胞亞群的比例。破壁靈芝孢子粉給藥治療組能調節免疫低下小鼠的淋巴細胞比例，對細胞免疫功能有恢復作用。

以上結果顯示，經破壁處理的靈芝孢子粉對小鼠的免疫功能有較明顯的促進作用，與非破壁靈芝孢子粉相比，作用明顯增強。這為免疫力低下患者提供了一種行之有效的中藥有效成分食用方法。