高頻電療對急性脊髓損傷大鼠神經功能恢復和BDNF-TrkB表達的影響

周剛，王佳君

（湖北省黃岡市中心醫院神經內科，湖北 黃岡 438000）

近年來隨交通運輸及建筑業發展，急性脊髓損傷（Acute spinal cord injury，ASCI）發生率呈上升趨勢[1]。目前尚無治療ASCI的理想方法，給患者家庭及社會帶來沉重負擔，其治療處于多途徑多學科探索階段。高頻電場療法（簡稱高頻電療）是一種應用波長為10-100 m的超高頻交流電作用于生物體，以達到治療目的。有基礎研究表明[2]，高頻電療可改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能，抑制Caspase3及海馬神經細胞凋亡，減輕神經元超微結構損傷，而發揮腦保護作用，但在ASCI中應用較少。本文應用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型，觀察高頻電療法（無熱量短波、超短波、微波）對其神經功能恢復及損傷段脊髓BDNF-TrkB表達的影響，為ASCI的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級成年雌性SD大鼠75只，均10周齡，體重22-24 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，在20-22℃、50%-60%濕度下飼養1周，自由進食和飲水，動物生產許可證號：SCXK（瀘）2013-0016。

誘捕早春出蟄活動的成蟲。可在院內按一定距離投放廢筍，一般上午8時～9時投撒，下午1時～2時收集捕殺。幼蟲活動性差，爬行緩慢，成蟲在清晨也很少飛翔，在其捕食為害時極易撲捉，利用成蟲的假死性用網蟲撲殺效果也較好。

1.2 主要儀器 手術器械，注射器，微細咬骨鉗，modelⅠ型NYU脊椎沖擊損傷儀（美國新澤西州立大學神經科學聯合中心）；日本伊藤SW180短波治療儀，南京產微波治療儀MTC-3-500，UWM-02型超短波治療儀（日本丸高）；石蠟切片機（德國萊卡），數顯恒溫漂片儀（常州中威），全自動HE染色機（丹麥 Dako），臺式高速離心機 （德國 Eppendorf），Olympus BX41顯微鏡（日本Olympus）等。

1.3 主要試劑 抗BDNF兔源單克隆抗體（美國ABcam公司）；抗TrkB兔源多克隆抗體（美國Millipore公司）；DAB顯色液（DAko）。

計算出d(Ei,Ej)后，再計算兩證據之間的相似度Sij=1-d(Ei,Ej)(i,j=0,1,2，…，k)，得到相似度矩陣S。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，所有數據均經軟件檢驗呈正態性分布且方差齊性，行t檢驗，服從正態分布各變量間相關性采用Spearman相關分析、以相關系數r表示兩資料間的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.1 Zea-Longa評分比較 隨時間延長，損傷各組評分均降低，但損傷各組各時點Zea-Longa評分均高于 S1組（P＜0.05）；各時點 S2、S3 組 Zea-Longa評分低于S4、S5組，且S3組各時點Zea-Longa評分低于S2組，2周、3周時S4組Zea-Longa評分低于S5組（P＜0.05）。見表 1。

1.4.3 干預治療 治療前均排空尿液，將其俯臥位固定在自制木制槽型裝置，在造模后1 d對損傷部位進行治療。S2組給予無熱量短波（頻率27.12 MHz，鼓形輻射器直徑7 cm）照射治療，輻射器垂直置于傷口上方及皮膚間隙2-3 cm，選擇連續輸出，照射強度10W，10min/次，1 次/d，照射至取材前 1 d；S3 組給予超短波治療，兩電極板對置于大鼠損傷區脊髓兩側，電極板與脊髓皮膚間隙2-3 cm，選擇第1檔輸出功率，照射強度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S4組給予微波治療（頻率2450 MHz，輻射器直徑10 cm），輻射器垂直置于傷口上方及皮膚間隔8 cm處，連續輸出，照射強度10 W，10 min/次，1次/d，照射至取材前1 d。S1組僅切除低T10胸椎及其上下棘突與椎板，不進行脊髓打擊，不進行物理因子治療；S5組在ASCI造模成功后不給于損傷部位物理因子干預。

1.4.2 ASCI模型制備 應用改良Alen’s法建立大鼠ASCI模型。按0.33 ml/100 g的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以T10棘突為中心備皮，將大鼠俯臥位固定在手術板上，以碘伏消毒，鋪無菌洞巾。沿T10中心在背部正中切開皮膚，逐層分離筋膜肌肉，后將T9-T11棘突與兩側椎板充分暴露，咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓背側硬膜，確保硬脊膜完整。應用NYU脊椎沖擊損傷儀在自硬脊膜25 mm高處自由垂直落下撞擊T10段脊髓硬脊膜，撞擊能量25 mm×10 g，損傷直徑2.5 mm。打擊后大鼠身體痙攣性顫動，尾巴出現痙攣性擺動，雙后肢及軀體回縮樣撲動，雙后肢弛緩性癱瘓，且硬膜表面充血水腫，即表明造模成功。術畢，無菌生理鹽水沖洗傷口，縫合，棉布巾覆蓋保溫，蘇醒后放回籠中飼養。在后肢肌注青霉素G20萬U預防感染，并人工擠壓膀胱協助排尿。S1組（假手術組）僅單純咬除T9-T11段椎板、棘突，而不損傷脊髓。

上述研究表明，跨文化交際學的“修辭轉向”重申了通過承認不同主張、文化或個體來建立一個和諧社會或世界，而不是對文化差異擺出不加分辨的寬容態度的重要性。

1.5.1 采用Zea-Longa五級評分法評估神經功能，0分：無神經功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展左前肢，輕度局灶性神經功能缺失；2分：向左側轉圈，中度神經功能缺失；3分：向左側傾倒，重度神經功能缺失；4分：不能自發行走，意識水平低，評分越高代表神經功能損傷越嚴重。于術前、脊髓損傷后1d、1周、2周、3周進行雙盲法評分。

1.5 觀察指標

1.2.3 感官評價。參考其他水產品的感官評定標準[7]，制定克氏原螯蝦的感官評定標準。由6名經過訓練的感官評定人員進行，按照表1進行綜合評分。在克氏原螯蝦凍結后0、10、20、30、40、50、60 d進行色澤、體表、肌肉及90 ℃水煮5 min 的氣味和湯汁評價。總分值在10分(最好品質)和0分(最差品質)。

1.5.2 BDNF、TrkB測定 ①取材及切片制備：于神經功能評分同時點取材，以10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，動物麻醉后斷頭，排空血液，打開暴露脊髓，剪取損傷區尾端L2-L5段脊髓組織，置于10%中性甲醛中固定；②經脫水、石蠟包埋、連續切片后，采用BDNF、TrkB試劑盒行免疫組化染色，中性樹脂封片保存，以PBSA代替一抗作陰性對照，以相應的陽性對照切片作陽性對照，在顯微鏡下（400×）觀察陽性細胞數（棕黃色），并拍照，以單個視野中陽性細胞數量進行統計學分析。

1.4 實驗動物分組與處理

2 結果

1.4.1 分組 將75只大鼠隨機分為S1、S2、S3、S4、S5五組，各15只。

表1 Zea-Longa評分比較（，分，n=15）

2.2 損傷各組BDNF、TrkB細胞陽性數比較 損傷1周時各組BDNF、TrkB細胞陽性數達高峰，且S3組最高，S2組次之，S4、S5 組低于 S2、S3 組（P＜0.05）；隨后均下降，2周時S2、S3組高于S4、S5組，S3組高于S2組（P＜0.05）；3周時S5組低于初始水平，且S2、S3、S4組高于 S5組，S3組高于 S2組、S4組（P＜0.05）；損傷 1d、1周、2周 S4組 BDNF、TrkB 陽性細胞數與S5組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2、表 3。

表2 損傷各組BDNF細胞陽性數比較（±s，個/視野，n=15）

表2 損傷各組BDNF細胞陽性數比較（±s，個/視野，n=15）

注：與同組損傷1d比較，①P＜0.05；與S2組同時點比較，②P＜0.05；與S3組同時點比較，③P＜0.05；與S4組同時點比較，④P＜0.05。

組別 1d 1周 2周 3周S2 5.64±0.62 13.16±1.15① 10.13±1.12① 6.64±0.71①S3 5.63±0.64 16.10±1.63①② 12.44±1.35①② 7.83±0.91①②S4 5.65±0.63 10.25±2.06①②③ 8.13±1.21①②③ 5.89±0.74①②③S5 5.66±0.63 9.82±0.99①②③ 7.91±0.85①②③ 5.19±0.62①②③④

表3 損傷各組TrkB細胞陽性數比較（±s，個/視野，n=15）

表3 損傷各組TrkB細胞陽性數比較（±s，個/視野，n=15）

注：與同組損傷1d比較，①P＜0.05；與S2組同時點比較，②P＜0.05；與 S3組同時點比較，③P＜0.05；與 S4組同時點比較，④P＜0.05。

組別 1d 1周 2周 3周S2 6.35±1.20 15.69±1.61① 10.56±1.17① 6.69±0.71①S3 6.32±1.23 19.88±2.10①② 12.89±1.34①② 7.35±0.75①②S4 6.34±1.21 12.56±1.31①②③ 8.99±0.91①②③ 6.53±0.58①②③S5 6.36±1.18 11.37±1.24①②③ 8.54±0.86①②③ 5.40±0.57①②③④

2.3 Zea-Longa評分與 BDNF、T rkB相關性分析ASCI大鼠損傷后3周內，Zea-Longa評分與BDNF、TrkB陽性率呈負相關（P＜0.05）。見表4。

表4 Zea-Longa評分與BDNF、TrkB相關性分析

3 討論

ASCI是臨床較嚴重的創傷性疾病，機體在外力、機械力所致的原發性損傷后，脊髓周圍結構局部缺血、出血、微循環損傷，繼而導致繼發性損傷，給臨床治療帶來嚴峻挑戰。動物及人體研究表明[3-4]，脊髓損傷后即使未經治療，缺損的神經功能也可部分恢復，證實脊髓存在一定的可塑性，這也提示臨床在治療ASCI時可由神經保護轉向促進神經再生，即促進神經元存活及替換，通過軸突再生與重塑而建立新的神經回路，部分代償喪失的神經功能。高頻電療是以生物體在高頻磁場中可表現出導體、電容、電介質、線圈等性質的原理的物理療法，治療時電極板發出高頻電磁波，產生震蕩電磁場，帶電離子在電場強度最大瞬間向磁場方向伸展，在電場強度最小瞬間離子又恢復原狀，當電磁波連續或脈沖式作用于生物體時，可產生電流，發揮熱效應或非熱效應，當電場頻率適當時，細胞受到刺激而引起生物學作用，其中最常見的為短波、超短波、微波，研究證實對神經損傷后的修復與再生有確切療效，但目前在ASCI中應用較少[5]。

本次研究結果顯示，隨著時間延長，損傷各組評分均降低，但損傷各組各時點Zea-Longa神經功能評分均高于S1組，而S2、S3組在各時點Zea-Longa評分優于S4、S5組，2周、3周時 S4組 Zea-Longa評分低于S5組，但S5組損傷后1-3周Zea-Longa神經功能評分較同組損傷1d呈下降趨勢，提示ASCI后，神經功能是一個自我恢復的過程，而采用高頻電療對神經功能損傷有較好的修復作用，縮短恢復時間，使神經功能盡快恢復，但微波療法不宜過早使用，且劑量應小，這與Pang等[6]通過研究得出的結論相近。BDNF為神經營養因子家族重要成員，通過旁分泌或自分泌作用與鄰近細胞膜特異性受體TrkB結合而促進神經元存活、增殖，突出其可塑性作用，繼而促進中樞神經系統損傷后軸突再生與修復[7-8]，Zhou等[9]的研究結果表明BDNF可能通過與其受體TrkB結合，而啟動眾多信號通路傳導，發揮其促進神經功能修復的作用，可見BDNF、TrkB在ASCI神經系統修復及肢體運動功能改善方面起著重要作用。本次研究結果顯示，損傷1周時各組BDNF、TrkB細胞陽性數達高峰，且S3組最高，S2組次之，S4、S5組低于S2、S3組，在損傷后1-2周時這種差異最明顯，而在3周差異趨勢減小，甚至在3周時S5組低于初始水平，而S2、S3、S4組BDNF、TrkB陽性細胞數維持在較高水平，此外相關分析顯示 ASCI大鼠損傷后 3周內，Zea-Longa評分與BDNF、TrkB陽性率呈負相關，這與謝財忠等[10]的研究結果相似，提示無熱量短波或超短波可較好調動內源性BDNF合成增加或轉運增加，促進局部運動及感覺神經元的存活、軸突生長，阻止神經元死亡、促進其存活與修復；微波也能刺激BDNF-TrkB表達，加快脊髓神經功能恢復，但效果較短波或超短波弱，考慮與微波超高頻電磁場中發生振蕩較短波、超短波更為劇烈，偶極子旋轉、有極分子擺動過于劇烈有關，對尚處于損傷急性應激刺激階段的脊髓來說可能是不利的。

綜上所述，高頻電療可明顯改善ASCI大鼠神經功能，促進神經功能恢復，可能通過上調BDNF-TrkB表達而發揮作用。

葉總接過話茬：“這么看來，我猜的就八九不離十了。老賈成功騙過我們之后，就剩下釣你教授上勾了。那天我提前離開酒席之后，他怕夜長夢多，便用錢盒子為餌，促成交易。仔細想想，看來老賈真的是以為這個盒子不太值錢，所以才把它當陪襯送給了陸教授。”