除濕通痹方對大鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型抗炎作用機制研究

昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011

痛風性關(guān)節(jié)炎是尿酸鈉在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成微晶體沉淀后引起的非特異性關(guān)節(jié)炎癥[1]，以關(guān)節(jié)的紅、腫、熱、痛為重要表現(xiàn)[2]，甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形，嚴重影響患者生活質(zhì)量[3]。除濕通痹方是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導下，結(jié)合臨床應用總結(jié)而來，有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本實驗觀察除濕通痹方對急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥程度、IL-1β、IL-1R影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級，SD大鼠72只，雌雄各半，購于購于四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所。生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2008-24，合格證號：0002777。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學院動物房，180～200 g，自由活動、進食。

1.2 藥物 秋水仙堿(規(guī)格：50 mg/片，批號：H53021369，西雙版納藥業(yè)有限公司)。除濕通痹方由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供(由王不留行、萆薢、荊芥、防風、川芎、羌活、元胡、牛膝、茯苓等組成，煎煮濃縮至2 g/mL)。

1.3 試劑 抗IL-1β抗原(西隴化工股份有限公司 33535)；PBS(索萊寶科技有限公司；P1010)；大鼠免疫組化試劑盒(索萊寶科技有限公司；G8590)等。

1.4 儀器 電子分析天平；顯微鏡；DECTA320 pH計；GB2292型套式恒溫器；振蕩混合器；離心機等。

2 方法

2.1 尿酸鈉結(jié)晶及尿酸鈉溶液的制備[6]將800 mg尿酸鈉和155 mL生理鹽水混合，加熱尿酸鈉溶解。滴入1 mol/L的鹽酸，調(diào)整pH 6.8～7.2。離心至晶體不再析出，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 除濕通痹方制備 將王不留行、元胡、牛膝、萆薢、羌活等中藥按劑量比列放置在套式恒溫器中，武火煮沸后改文火煎煮，濃縮藥液至2 g/mL 。

2.3 動物模型的制備 采用 Coderre方法[7]造模。水合氯醛麻醉、消毒，將尿酸鈉溶液 (50 mg/mL)注入踝關(guān)節(jié)腔，復制急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型。

2.4 分組及給藥 SD大鼠72只，隨機分為6組，分為空白組、模型組[4 mL/(kg·d)]、秋水仙堿組[0.0012 g/(kg·d)]為陽性組,除濕通痹方低劑量組[9 g/(kg·d)]、中劑量組[18 g/(kg·d)]、高劑量組[36 g/(kg·d)]。除空白組外，余5組大鼠復制大鼠急性痛風性關(guān)節(jié)炎模型。造模后2 h后開始灌胃，連續(xù)灌胃7d，處死大鼠取材[8]。

2.5 觀察指標

2.5.1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度 每只鼠注射尿酸鈉(MSU)晶體溶液前及注射MSU晶體溶液2 h左后足容積。足跖腫脹度為注射MSU前后大鼠左后足容積之差。

2.5.2 關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)炎癥細胞計數(shù)(淋巴細胞、巨噬細胞) 第7d灌胃3 h后麻醉處死大鼠，取左踝關(guān)節(jié)軟組織。常規(guī)甲醛液固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟，包埋，切片4 m，蘇木精一伊紅染色。用Image Pro-Plus 6.0行圖像分析。

2.5.3 關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1β、IL-1R 石蠟切片常規(guī)脫蠟，過氧化氫去內(nèi)源性酶，胰酶消化暴露抗原，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗、酶標記鏈霉卵白素過氧化物酶，聯(lián)苯二胺 (DAB) 顯色。

2.6 統(tǒng)計方法 用Image Pro-Plus 6.0行圖像分析后采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠左足跖腫脹度的比較 由表1可知，造模后第3d，與模型組比較，各給藥組差異無統(tǒng)計學意義；造模后第7d，與模型組比較，各給藥組足腫脹度均顯著降低 (P<0.01)；除高劑量組與陽性組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

表1 各組大鼠左足趾腫脹度的比較

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織切片中單位面積炎癥細胞計數(shù)比較 由表1可知，與空白組比較，其余各組的關(guān)節(jié)切面中均產(chǎn)生大量淋巴細胞及巨噬細胞(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組差異均有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中淋巴細胞計數(shù)陽性組與除高組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中 IL-β、IL-1R 表達的比較 由表3可知，與空白組比較，模型組、陽性組、除濕通痹方各劑量組的 IL-β、IL-1R平均光密度值均升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組平均光密度值顯著降低(P<0.05)； 陽性組與除中、低組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，此三組與除高組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中單位面積炎癥細胞計數(shù)比較 (個

表3 各組大鼠IL-1β、IL-1R平均光密度值的比較

4 討論

急性痛風性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，臟腑失職、脾虛不運；臟腑陽盛積熱，日久成病[9]；急性期當以“通”為治則，通濕、除痰、化瘀，以“通”止痛，“通則不痛”[9]，由此組方為除濕通痹方。方中王不留行消腫止痛；萆薢祛風除痹，川木通通利關(guān)節(jié)；茯苓、澤瀉泄腎濁；桔梗利五臟，荊芥、防風勝濕止痛，止痙定搐；牛膝通經(jīng)除痹[9]。諸藥合用有益氣補脾腎、祛濕、降濁、通竅作用[9]。

實驗通過比較大鼠左足趾腫脹程度及軟骨組織中炎癥細胞數(shù)量，來觀察除濕通痹方是否具有消炎、抗腫的功效。且IL-1是炎癥級聯(lián)放大效應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要以IL-1β形式存在關(guān)節(jié)內(nèi)，是炎癥調(diào)節(jié)的始動因素[10-12]。因此抑制IL-1β是防治痛風性關(guān)節(jié)炎的有效途徑。結(jié)果顯示：各給藥組平均光密度值顯著低于模型組(P<0.05)；陽性組、除低組、除中組與除高組比較，差異顯著(P<0.05)。說明各給藥組對IL-1β、IL-1R的表達有抑制作用，其中，除濕通痹方高劑量組抑制作用較除濕通痹方低劑量組、中劑量組強。本研究結(jié)果為除濕通痹方治療急性痛風性關(guān)節(jié)炎提供了實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥治療急性痛風性關(guān)節(jié)炎提供實驗數(shù)據(jù)。除濕通痹方可用于急性痛風性關(guān)節(jié)炎的治療,其作用機制可能與阻斷關(guān)節(jié)軟組織內(nèi)IL-1β和IL-lR的表達有關(guān)。