探討術中冰凍各環節的注意事項和應用體會

吳鵬

（浙江省腫瘤醫院病理科 浙江 杭州 310022）

利用冰凍切片技術對送檢標本進行術中診斷已經普遍應用于外科手術的快速病理診斷。自1960年Cryostat冰凍切片機應用以來，目前國內外臨床通過術中冰凍診斷來決定下一步的手術方式及手術范圍，已經成為外科手術的重要方式[1]。而隨著病理從業人員素質的提高和冰凍切片設備的更新換代，冷凍切片質量和常規石蠟切片差別越來越小，病理醫生對術中冰凍切片診斷的準確率也得到了提高[2-4]。而伴隨著診療技術的不斷發展，各臨床科室對術中冰凍的要求也越來越高。基于此，就需要我們對冰凍切片各個環節進行系統性探討，總結一些影響冰凍切片質量的因素和注意事項。來提高切片質量以利于病理診斷和臨床診療方案的選擇。

1.材料與方法

1.1 材料

本院外科手術送檢組織標本涉及甲狀腺、肝臟、宮頸、乳腺、卵巢、肺、腦、淋巴結及各類切緣等。所有標本均及時新鮮送檢，不加任何處理。

1.2 設備及耗材

采用Thermo恒溫冰凍切片機；醫用超聲耦合劑（KL-250型，杭州凱普樂醫療器械有限公司）[5]；Thermo MX35一次性刀片。

1.3 試劑

甲醇固定液[6]；改良Gill蘇木素染液[7]；醇溶性伊紅染液；促藍液；脫水用梯度酒精；二甲苯。

1.4 方法

1.4.1 取材 送檢手術標本取材對制片的影響非常重要，不但要求及時、規范。還要注意幾點事項：（1）送檢標本必須無固定，不經任何液體浸泡。（2）取材臺面必須保持干凈，避免污染。（3）取材刀要鋒利，避免擠壓組織。（4）取材刀，剪，鑷子保持干凈，每次取材后洗凈，擦干。（5）組織大小厚薄適宜（1.5cm×1.5cm×0.3cm），冰凍取材可略厚（0.3～0.4cm）[8]。（6）送檢標本遇有較多血液和液體時要充分吸干，避免冰晶形成[9]。（7）取材時盡量剔除不相關的部分（脂肪，毛發，線結，骨組織及鈣化）

1.4.2 包埋 根據組織大小在冷凍頭上涂上醫用超聲耦合劑，將取材后最利于診斷的切面朝上放置，并馬上置于速凍臺上速凍，同時使用冷凍錘壓置。實踐證明，使用冷凍錘壓置標本既可以加快冷凍速度，減少冰晶的出現[10]。還可以壓平標本切面，有利于切出標本最大面。注意事項：（1）耦合劑略多于組織，能將組織包裹住為宜。（2）冷凍錘要輕拿輕放。（3）速凍是防止冰晶形成的有效方法。

1.4.3 切片 待新鮮組織快速冷凍后將冷凍頭移至凍頭夾，緩慢后退凍頭至合適距離開始修片，修片過程動作要輕柔，不可過快修片，以免組織脫落或損壞刀口。調整好防卷板位置，確認切片厚度，開始切片。切出一張平坦無折褶的薄片后，快速粘附于載玻片上。（1）切片刀要鋒利。（2）厚度一般以4～5μm為宜，脂肪組織可為10～15μm（見表1）。（3）淋巴結、肝等細胞豐富的組織在過凍發裂的情況下，可用手敷使其回溫后再行切片。（4）在使用防卷板的情況下仍無法順利出片的情況下，可用毛筆協助拉片。（5）粗修后要細切掉前面幾張，避免切片出現孔隙。（6）轉動冰凍機手柄要用力均勻，切忌猛修猛切。

冰凍切片的溫度、時間控制是切片好壞非常關鍵的一步。應根據組織的大小、厚薄、種類來確定冷凍的時間。但是在實際工作中，由于送檢標本數較多，頻繁調試冰凍切片機的溫度不切實際，故一般在室溫較高時將冰凍切片機箱體溫度設為-25℃左右[8]，在室溫較低時將切片機箱體溫度調至-20℃左右。速凍臺設置速凍溫度-35℃～-50℃。凍頭溫度應根據組織情況來設置，一般設置在-20℃左右。

表1 常見組織凍頭溫度，冷凍時間，切片厚度建議

1.4.4 固定及染色 將粘附有薄切片的載玻片快速放入甲醇液中固定，不洗直接浸入蘇木素染液1～1.5分鐘，水洗后促藍液藍化充分水洗，入伊紅染色5～10秒，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。（1）固定液經常更換，固定時間要充足，尤其是細胞成分豐富的組織。（2）最好使用新鮮蘇木素染液。（3）室溫過低時，最好加溫蘇木素染液再進行染色[11]。（4）促藍液藍化后水洗要充分，防止伊紅著色欠佳。（5）切片呈云霧狀時要按順序返回到低濃度酒精重新脫水透明封固。

2.結果

針對不同組織在制片過程中的注意事項，制作出的切片切面平坦完整 ,厚薄均勻、無皺折，鏡下組織結構完整，細胞形態清晰，染色鮮艷，細胞質與細胞核紅藍對比明顯，細胞無明顯腫脹和收縮，無空泡，無人為裂隙及無冰晶等。鏡下觀察的細胞形態能完整地呈現，類似于常規石蠟切片，層次分明，分辨率良好。（圖1）

圖1 細胞形態清晰，染色鮮艷，對比度好，類似于常規石蠟切片

3.討論

術中冰凍的目的是要求在短時間內作出準確的病理診斷，幫助外科醫生確定病變的性質，決定手術的方式和范圍。冰凍切片的原理是在低溫條件下使組織快速冷凍至一定硬度，然后進行切片的方法。其制作過程較常規石蠟切片快速、簡便。目前已經廣泛應用于臨床手術中。所以要快速完成一張高質量的冰凍切片非常重要，各個環節要注意的細節也很多，從取材、包埋到切片、固定、染色等過程。針對不同組織要選擇不同的溫度、時間及厚度，其中冷凍溫度和時間的控制是非常關鍵的。不同組織應該選用不同的技巧，不可一概而論。但是想要做好一張冰凍切片并非易事，這需要病理技術人員具有嚴謹的工作態度、仔細的工作作風和長期的練習和摸索。對每一例送檢的病理標本都要嚴謹、仔細的進行制作。在制片工作中做到每一個環節都能精于求精。并要求能在工作之余進行總結和經驗積累，從而提高自身的業務水平，為病理診斷及臨床應用提供更好的保障。