茶樹品種及生長期對茶葉有機酸含量的影響

劉盼盼， 鄭鵬程， 郭桂義， 金孝芳， 尹 鵬， 高士偉， 王勝鵬， 葉 飛， 鄭 琳， 龔自明

(1.湖北省農業科學院果樹茶葉研究所/湖北省茶葉工程技術研究中心，湖北武漢 430064； 2.信陽農林學院/河南省豫南茶樹資源綜合開發重點實驗室，河南信陽 464000)

茶葉中主要有奎尼酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸、沒食子酸等近30種有機酸[1]。茶葉中的脂肪族有機酸對滋味的貢獻較大，而芳香族有機酸等是香氣的主要成分，它們在茶葉沖泡過程中大多數可被浸出到茶湯中，成為影響茶湯風味品質的主要成分之一[2]。眾多研究證實，有機酸有很強的抗氧化能力，對茶多酚、維生素等組分的抗氧化活性有明顯的增效作用[3-5]。有機酸作為食品添加劑也被廣泛用于果、蔬汁飲料中，其中檸檬酸、蘋果酸和酒石酸主要作為酸味劑，而抗壞血酸常作為抗氧化劑[6]。

目前，茶葉中有機酸的分析方法主要有酸堿滴定法、氣相色譜法、離子色譜法、毛細管電泳法和高效液相色譜法等[7-10]。其中酸堿滴定法影響因素較多，準確度較差；氣相色譜法需要在分離前對有機酸進行衍生，樣品前處理繁瑣費時且回收率低；離子色譜法由于對樣品中蛋白質含量有嚴格的限定，不適合作復雜的樣品分析，且對低分子量有機酸檢測的準確度不高；毛細管電泳法相對于其他分析方法來說，重現性存在明顯不足；高效液相色譜法具有靈敏度高、分離效果好的優點，是目前有機酸分析中最成熟、也最常用的方法[11-12]。劉盼盼等研究了不同葉位、不同品種和不同茶類茶葉中有機酸的含量，以及不同沖泡條件下有機酸的浸出特性，結果表明奎尼酸、蘋果酸的含量較高，有機酸隨著鮮葉嫩度下降而減少，福鼎種的含量較低而黃金桂的含量最高，紅茶中有機酸含量最高[1]。黎爽等建立了白茶中8種有機酸的HPLC方法，檢測結果顯示，乙酸是白茶中的主要有機酸，有機酸總量隨著鮮葉等級的降低呈下降趨勢[13]。趙和濤研究表明，紅茶經過萎凋、揉捻、發酵等加工工序后，有機酸總量呈增長趨勢，如水楊酸等有機酸，鮮葉中含量為29.60%，萎凋葉中含量為 32.21%，發酵葉中含量為43.82%，直至干燥時才有所降低[14]。謝嬌枚等對祁門紅茶進行品質分析發現，在長時間的存放過程中，祁門紅茶的酸類物質總量增加明顯，但各有機酸組分含量均有所改變，如草酸、乙酸等物質含量顯著增加，而檸檬酸明顯降低，使得茶湯滋味變酸且口感變差[15]。

目前，有關福鼎大白和中茶108品種鮮葉在不同生長期內有機酸含量的變化尚未見報道，本研究通過優化色譜條件，建立了采用高效液相色譜法檢測茶葉中10種有機酸的測定方法，分析比較了福鼎大白和中茶108品種鮮葉在不同生長期內有機酸含量的變化規律，為茶葉加工工藝優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料均采自湖北省農業科學院果樹茶葉研究所金水基地茶園，于2016年4月，根據不同茶樹品種萌動期20 d后每隔一段時間采摘中茶108和福鼎大白2個茶樹品種的新梢部分，先進行微波殺青，然后80 ℃烘干固樣，磨碎后裝入鋁箔袋，低溫儲藏。不同采摘日期見表1。

H3PO4(色譜純)，天津科密歐化學試劑公司；KH2PO4(分析純)，阿拉丁試劑；草酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗壞血酸、沒食子酸標準品，源葉生物有限公司。

1.2 儀器設備

Waters 2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器；Milli-RO PLUS 30純水機，法國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 有機酸標準溶液配制 分別稱取草酸、奎尼酸、酒石酸、蘋果酸20 mg，乳酸10 mg，檸檬酸、琥珀酸、莽草酸20 mg，抗壞血酸10 mg，沒食子酸20 mg至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度配制成混標儲備液。混標中上述各標準品的濃度分別為2.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0 mg/mL。分別量取混標溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾后，得到不同濃度的有機酸混合標準品工作液。

表1 茶樹品種及生長期對有機酸含量影響的試驗設計

1.3.2 樣品前處理 稱取3.0 g磨碎茶于錐形瓶中，用 450 mL 純凈水沖泡，在沸水浴鍋中浸提45 min，抽濾至 500 mL 容量瓶中，冷卻后定容，用0.22 μm的膜過濾，分析有機酸含量。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Atlantis T3 Column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀(用磷酸調pH值至2.8)，流速為0.6 mL/min，進樣量10 μL；紫外檢測器波長210 nm。

2 結果與分析

2.1 HPLC檢測有機酸色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 本研究采用二極管陣列檢測器(DAD)進行檢測，混合標準品進樣后對各有機酸的DAD圖譜進行分析：在190～400 nm波長范圍內，有機酸的吸收強度基本呈現先上升而后下降趨勢，發現在210 nm處均有較大吸收峰，且基線穩定、噪音小。因此，確定檢測有機酸的波長為210 nm。

2.1.2 流動相濃度、流速、pH值選擇 磷酸鹽緩沖溶液是最典型適用的洗脫液，在紫外區幾乎無吸收，常作為有機酸測定的流動相[13]。本試驗以磷酸二氫鉀為流動相，考察了0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L 4個不同濃度對有機酸混合標準品進行分離，發現出峰時間和分離度無明顯變化(圖1)，但是高濃度磷酸鹽容易在儀器和色譜柱中結晶析出，因此，確定采用0.02 mol/L磷酸二氫鉀為流動相。

2.2 標準曲線繪制與線性范圍考察

將各有機酸標準試劑分別配成單一的標準溶液，在同一色譜條件下分別進樣，確定每種有機酸的保留時間，根據保留時間定性。然后將不同濃度的有機酸單標混合成混標溶液，從低濃度到高濃度依次進樣，計算各自的峰面積(每個樣平行進樣3次)。按試驗結果繪制各有機酸的標準曲線，以色譜峰面積為橫坐標(X)，有機酸濃度為縱坐標(Y)，計算標準曲線方程(表2)。10個有機酸峰面積和濃度的相關系數在0.991 8～0.999 6之間，在一定的濃度范圍內線性關系良好。

表2 有機酸標準曲線及精密度分析

2.3 方法回收率

選擇108-1樣品作為加標基質，重復添加3次，10種有機酸的加標回收率為95.33%～101.42%(表3)，表明該處理樣品的方法具有較高的回收率，適合對茶葉中有機酸檢測分析。

2.4 樣品中有機酸含量

使用優選的色譜條件對20個茶葉樣品分別進行檢測，不同茶樹品種不同生長階段有機酸含量見表4。從表4可以看出，共檢出10個有機酸組分，中茶108、福鼎大白2個品種樣品的有機酸總量的平均值相近，在生長期內均呈先增加后減少的趨勢，但中茶108樣品在60 d時有機酸總量最高，為 57.98 g/kg；福鼎大白樣品在30 d時有機酸總量最高，為 68.55 g/kg。中茶108、福鼎大白2個品種在不同生長期奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量最多，分別為20.24、8.66、5.68 g/kg，分別占有機酸總量的43.81%、18.75%和 12.29%。乳酸含量最低，尤其是在大部分福鼎大白樣品中未檢出。奎尼酸、莽草酸在生長期內與有機酸總量的變化趨勢含量為 46.21 g/kg， 以奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量較一致，而蘋果酸與抗壞血酸在生長期內呈持續減少趨勢，草酸相對穩定，其他有機酸變化無明顯規律。

表3 有機酸回收率試驗

3 結論

本試驗對茶葉中有機酸的檢測條件進行了優化，確定了以0.02 mol/L磷酸二氫鉀(pH值2.8)為流動相，Atlantis T3 Column為色譜柱，10種有機酸，即草酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗壞血酸、沒食子酸在 210 nm 處得到完全分離。對不同品種茶葉在不同生長期階段的有機酸進行了檢測分析，結果表明，中茶108和福鼎大白品種鮮葉含有的有機酸種類無明顯差異，10種有機酸均有檢出。樣品各自的有機酸總量可達到22.12～68.55 g/kg，平均含量為 46.21 g/kg， 以奎尼酸、沒食子酸、檸檬酸平均含量較高，分別為20.24、8.66、5.68 g/kg。有機酸是茶葉品質成分的重要組成部分，與茶葉品質的相關性還未開展系統研究。不同茶樹品種、不同生長期的有機酸種類和含量均有一定差異，因此，今后要明確各種有機酸組分對茶葉品質的影響，有針對性地選擇適宜的茶樹品種，在最佳生長期內采摘鮮葉進行加工，為茶葉品質的提高提供理論依據。

表4 不同茶樹品種在不同生長階段的有機酸含量

注：ND表示未檢出。