鬼針草不同溶劑萃取物的總黃酮含量及抗氧化、酶抑制活性

楊秀東， 張嬪妹， 王亞紅， 崔 浩， 周鴻立

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.吉林化工學(xué)院圖書館，吉林吉林 132022)

糖尿病是一種慢性高血糖和糖脂代謝、蛋白質(zhì)代謝紊亂為主要特點(diǎn)的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病原因主要為胰島素分泌不足和胰島素抵抗，目前，糖尿病已經(jīng)成為威脅人類健康的第三大疾病。研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能的損傷和外周胰島素抵抗，從而誘發(fā)糖尿病的形成，繼而引發(fā)多種并發(fā)癥。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是人體中影響飲食淀粉和糖類等主要碳水化合物消化和吸收的關(guān)鍵酶，其抑制劑能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶的活性，延緩腸道碳水化合物的吸收，從而有效抑制餐后血糖升高，常用于二型糖尿病的治療。常用的此類藥物有阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等，這些藥物都存在胃腸不適等副作用，因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效、安全的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑成為開發(fā)糖尿病治療藥物的研究熱點(diǎn)。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一種天然多酚類化合物，具有高藥理活性的特點(diǎn)。研究表明，黃酮類化合物對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有明顯的治療作用，其作用機(jī)制呈現(xiàn)多途徑多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，抗糖尿病的主要作用機(jī)制包括抗氧化、胰島β細(xì)胞保護(hù)及功能調(diào)節(jié)、抑制糖苷酶活性、促進(jìn)外周組織對(duì)糖的利用、抗炎及增強(qiáng)免疫功能等。研究黃酮類化合物對(duì)糖尿病的防治具有非常重要的意義。

鬼針草(BidensPilosaL.)始載于《本草拾遺》，屬于菊科(Asteraceae)鬼針草屬(Bidens)植物。鬼針草味苦無毒，具有清熱解毒、活血散瘀、消炎消腫的功效，也可用于治療痢疾、感冒、腹瀉、炎癥等[1-2]。鬼針草的主要化學(xué)成分包括黃酮類、揮發(fā)油類、酚酸類、有機(jī)酸類及甾體類環(huán)合物等[3-7]。現(xiàn)代藥理作用研究表明，鬼針草提取物具有抗氧化、抗炎、抗菌、肝保護(hù)作用及降血糖作用[8-11]；鬼針草乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取物能夠降低正常小鼠的血糖，其中乙酸乙酯提取物具有降低四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的作用[12]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，鬼針草總黃酮對(duì)糖尿病小鼠具有降血糖作用，其作用機(jī)制為通過調(diào)控PI3K/AKT/GLUT4信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子的基因和蛋白的表達(dá)，從而改善細(xì)胞胰島素抵抗[13]。本研究對(duì)鬼針草不同提取物進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，通過液質(zhì)聯(lián)用法初步鑒定其中的黃酮類成分，研究各提取物的體外抗氧化能力，并對(duì)其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，為鬼針草的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鬼針草購于吉林大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)李勇教授鑒定為菊科植物鬼針草的干燥地上部分。

蕓香苷、PNPG，上海金穗生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、ABTS、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，上海晶純生化科技股份有限公司；鬼針草購于吉林大藥房；其他試劑均為分析純。

蕓香苷對(duì)照品，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-10060，純度>98.5%；α-葡萄糖苷酶，美國Sigma公司，(批號(hào)：G5003)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，美國Sigma公司，(批號(hào)：N100371) ； 阿卡波糖(50 mg/片)，德國Bayer公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海晶純生化科技股份有限公司；α-淀粉酶，美國BR公司，(批號(hào)：9000-90-20)；其他試劑均為分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SpectraMax Plus384型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠； HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；SHB-Ⅲ A型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FA2004N型分析天平，上海精密科學(xué)股份有限公司；LTQ型離子阱質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；Eppendorf centrifuge 5810R 臺(tái)式高速大容量離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取及制備 干燥的鬼針草200 g粗粉，加10倍量水，浸泡過夜，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液水浴濃縮得水提液1 000 mL，加入95%乙醇至含醇量為80%，室溫放置過夜，抽濾，減壓濃縮。然后依次用氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取2次，各萃取層減壓濃縮后分別得萃取物875.0、348.9、684.5、9 930.0 mg。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 精密配制0.2 mg/mL對(duì)照品蕓香苷的標(biāo)準(zhǔn)液，精密吸取蕓香苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，然后加入5 % NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10 % Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4 % NaOH溶液4.0 mL，最后加入80 %乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min。以80 %乙醇溶液為空白對(duì)照，用紫外分光光度法于515 nm波長處測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮含量。鬼針草不同提取物按上述方法提取，于515 nm 波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 清除DPPH自由基活性 鬼針草各提取物DPPH清除作用參考相關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn)方法[14]并加以改良，DPPH用甲醇溶解配制成0.16 mmol/L 的甲醇溶液。取不同濃度的樣品甲醇溶液和維生素C甲醇溶液100 μL分別加入96孔板，并加入100 μL的DPPH溶液，空白用甲醇代替樣品溶液。混合均勻后室溫避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm下測(cè)定其吸光度(D)。每份樣品平行操作3次。

清除率=[D空白-D樣品]/D空白×100%。

提取物的半數(shù)抑制率用IC50值表示。

1.2.3.2 超氧陰離子清除 鬼針草各提取物超氧陰離子清除作用參考相關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn)方法[15]并加以改良。超氧陰離子清除試驗(yàn)反應(yīng)體系包括：200 μL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，20 μL不同濃度的鬼針草樣品溶液或維生素C溶液，20 μL 的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合后立即放入酶標(biāo)儀中，連續(xù)測(cè)定4 min，以吸光度變化率計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率。

1.2.4 體外酶活性測(cè)試

1.2.4.1 鬼針草黃酮化合物對(duì)α-淀粉酶活性的抑制 分別取20 μL不同濃度樣品溶液，加入20 μL淀粉酶溶液，37 ℃ 水浴搖床中孵化10 min，加40 μL淀粉溶液，37 ℃水浴搖床中反應(yīng)15 min，加20 μL鹽酸終止反應(yīng)，加100 μL稀碘液，顯色，用酶標(biāo)儀于595 nm處測(cè)其吸光度(D)。對(duì)照組用PBS代替淀粉酶溶液，空白用PBS代替樣品。

α-淀粉酶活性抑制率計(jì)算公式：

抑制率=D樣品/(D對(duì)照-D空白)×100%。

1.2.4.2 鬼針草黃酮化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制 鬼針草各提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)參照相關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn)方法[16]，分別移取10 mg/mL各提取液500 μL至1.5 mL 離心管中，分別配成不同濃度梯度的樣品溶液。取50 μL 磷酸緩沖溶液于96微孔板中，后分別取不同濃度樣品60 μL，酶溶液60 μL，50 ℃水浴20 min，再加底物PNPG 30 μL，50 ℃水浴40 min，加100 μL的Na2CO3終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在 405 nm 處測(cè)定其吸光度(D)。對(duì)照組用PBS代替酶溶液，空白用PBS代替樣品。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率計(jì)算公式：

抑制率=[1-D樣品/(D對(duì)照-D空白)]×100%。

1.2.5 液相-質(zhì)譜連用鬼針草中化合物的鑒定

1.2.5.1 樣品的制備 取上述制備的水提物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物適量，用氮?dú)獯蹈桑孟嗤w積的水溶解，過0.22 μm微孔濾膜過濾，用于鬼針草提取物中黃酮類化學(xué)成分的研究。

1.2.5.2 UPLC-MS條件 Finnigan LTQ質(zhì)譜儀：電噴霧離子源，毛細(xì)管溫度270 ℃；噴霧電壓 4.0 KV，透鏡電壓-250 V；毛細(xì)管電壓-41 V；質(zhì)量檢測(cè)范圍m/z：200～1 500；注射泵流速5 μL/min；鞘氣為氮?dú)猓魉?0 mL/min；串聯(lián)質(zhì)譜碰撞能量為30～35 V。

色譜柱為Kromasil C18柱 (250 mm × 4.6 mm，5.0 μm)；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相流速為0.5 mL/min；柱溫為20 ℃，流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；負(fù)離子模式下梯度洗脫(0～5 min，7%～20% A； >5～15 min，20%～30% A； >15～25 min，30%～40% A； >25～45 min，40%～60% A； >45～55 min，60%～100% A；> 55～60 min，100% A； >60～70 min，100%～7% A)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鬼針草各提取物總黃酮含量

鬼針草的水提物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物的總黃酮含量分別為生藥材的0.71%、1.01%、4.23%、3.57%和1.86%。結(jié)果表明，鬼針草乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物的總黃酮含量最高。

表1 鬼針草不同溶劑提取物總黃酮含量

2.2 鬼針草不同提取物抗氧化活性

2.2.1 鬼針草不同提取物對(duì)DPPH清除能力 鬼針草不同提取物對(duì)DPPH清除能力見圖1。不同有機(jī)相萃取物均具有較強(qiáng)的DPPH清除能力，且清除率呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，其中，乙酸乙酯萃取物的清除率明顯高于其他提取物，當(dāng)濃度為0.2 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到87.2%。氯仿萃取物的清除作用僅次于乙酸乙酯萃取物。水提物和水萃取物的清除率明顯低于其他提取物。從表2可以看出，其IC50值為：維生素C<乙酸乙酯萃取物<氯仿萃取物<正丁醇萃取物<水萃取物和水提物，表明鬼針草不同提取物對(duì)DPPH的清除能力均弱于維生素C。

2.2.2 超氧陰離子清除率 鬼針草不同提取物對(duì)超氧陰離子清除率結(jié)果見圖2。不同提取物在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均顯示了一定的超氧陰離子清除能力，其中，有機(jī)溶劑萃取物的清除能力明顯高于水相提取物，乙酸乙酯萃取物在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)顯示了較高的清除能力，在0.8、1.6 mg/mL時(shí)，其清除能力分別為80.8%、90.5%。在此濃度下，氯仿萃取物和正丁醇萃取物對(duì)超氧陰離子的清除率相當(dāng)。不同提取物及陽性對(duì)照維生素C的超氧陰離子清除作用IC50值見表3，乙酸乙酯萃取物的超氧陰離子清除作用的IC50值小于維生素C的IC50值，說明其清除超氧陰離子的能力強(qiáng)于維生素C。

表3 鬼針草不同提取物對(duì)超氧陰離子清除能力的IC50值

2.3 鬼針草不同提取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同濃度鬼針草提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用見圖3，其中，氯仿萃取物及乙酸乙酯萃取物對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯萃取物的抑制率最高，達(dá)到60.27%，而氯仿萃取物稍低，為47.39%。水提物、正丁醇萃取物和水萃取物的抑制作用均不明顯。作為陽性對(duì)照藥物，阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制作用的IC50值為 0.10 mg/mL。乙酸乙酯萃取物的IC50值為0.81 mg/mL，其他不同提取物的IC50值均大于1.0 mg/mL，表明鬼針草乙酸乙酯萃取物和氯仿萃取物具有較好的α-淀粉酶抑制作用，但抑制作用弱于阿卡波糖。

從圖4可以看出，鬼針草不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用，其抑制作用與濃度呈依賴關(guān)系，其中，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用稍高于其他提取物，當(dāng)濃度為2.0 mg/mL，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用分別為41.2%、45.6%。陽性對(duì)照藥物阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯高于鬼針草不同提取物，其抑制作用的IC50為0.10 mg/mL，而不同提取物的IC50均大于2.0 mg/mL。表明鬼針草不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，但抑制作用低于阿卡波糖。

2.4 鬼針草乙酸乙酯萃取物中化學(xué)成分分析

鬼針草乙酸乙酯萃取物總離子流見圖5。鬼針草中含有黃酮類、酚酸類及皂苷類成分，為了有效地提高分離效果，首先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行選擇，結(jié)果表明乙腈-甲酸水流動(dòng)相分離效果優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，由于乙酸乙酯萃取物中含有化學(xué)成分較多，因此，采用柱長為250 mm的色譜柱，得到的分離效果較好。

(1)1號(hào)化合物的鑒定：其保留時(shí)間為15.32 min，準(zhǔn)分子離子峰[M+HCOOH]-為315，其相對(duì)分子質(zhì)量為270，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品芹菜素一致，因此化合物鑒定為芹菜素。(2)2號(hào)化合物的鑒定： 其準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-為433，所以其相對(duì)分子質(zhì)量為434，二級(jí)質(zhì)譜顯示，產(chǎn)生碎片離子[M-H-162]-(m/z)271，即失去1個(gè)m/z162的中性片段，為其失去葡萄糖中性片段(3)，結(jié)合文獻(xiàn)[17]可以確定為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。(3)3號(hào)化合物的鑒定：其準(zhǔn)分子離子峰[M+HCOOH]-為477，所以其相對(duì)分子質(zhì)量為432，二級(jí)質(zhì)譜顯示，產(chǎn)生碎片離子[M-H-162]-(m/z)269，即失去1個(gè)m/z162的中性片段，為其失去葡萄糖中性片段，結(jié)合文獻(xiàn)[18]，確定為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。(4)4號(hào)化合物的鑒定：其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為447，所以其相對(duì)分子質(zhì)量為448，二級(jí)質(zhì)譜顯示，產(chǎn)生碎片離子[M-H-162]-(m/z)285，即失去1個(gè)m/z162的中性片段，為其失去葡萄糖中性片段，結(jié)合文獻(xiàn)[19]可以確定為木犀草苷。(5)5號(hào)化合物的鑒定：其準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為285，所以其相對(duì)分子質(zhì)量為286，二級(jí)質(zhì)譜顯示，產(chǎn)生碎片離子[M-H-44]-(m/z)241，即失去1個(gè)m/z44的中性片段，為其失去-CO2，結(jié)合文獻(xiàn)[18]可以確定為木犀草素(表4)。

表4 鬼針草乙酸乙酯萃取物的質(zhì)譜分析結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用了水提醇沉法對(duì)鬼針草總黃酮進(jìn)行提取，并進(jìn)一步用溶劑萃取法對(duì)水提液進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，各有機(jī)相中總黃酮含量較高，其中乙酸乙酯萃取物總黃酮含量最高。抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各有機(jī)相萃取物對(duì)DPPH和超氧陰離子清除率高于水相萃取物及水提物，推測(cè)其抗氧化能力與總黃酮含量相關(guān)。酶活性抑制試驗(yàn)表明，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有較強(qiáng)的抑制作用。采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)乙酸乙酯萃取物中的黃酮類成分進(jìn)行了初步鑒定，分析其中各峰的碎片離子，并結(jié)合文獻(xiàn)，其中幾種黃酮類化合物分別鑒定為芹菜素、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草苷和木犀草素。鬼針草提取物中的黃酮類成分可能是其抗氧化和酶抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，這為鬼針草的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。