魚腥草活性成分槲皮素及其金屬配合物的抗菌活性

徐海瑛， 郝紅英， 陳青閣， 趙優琴， 李玉魁， 周小漫， 馬 欣， 丁燕偉

(黃河科技學院醫學院，河南鄭州 450063)

魚腥草(Houttuyniacordata)為三白草科蕺菜屬植物，主要產于浙江、江蘇、安徽、福建、河南等省，作為藥食兩用的植物，魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功能[1]。現代藥理學研究表明，魚腥草具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤和提高免疫力等生理功效[2]。此外，魚腥草含有多種活性物質成分，主要活性物質有揮發油和黃酮類化合物，如魚腥草素、槲皮素、槲皮苷等[3]。槲皮素是植物界分布最廣的黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。由于槲皮素的水溶性較差，人們通常對槲皮素進行結構修飾。槲皮素對金屬離子有很強的螯合作用，可以產生穩定的環狀化合物，因此，近年來人們對槲皮素配合物的研究逐漸增多，成為開發利用槲皮素的新途徑。

近年來，國內外研究者已經合成了30多種槲皮素金屬配合物，有些金屬配合物具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌活性[7]。關于魚腥草有效成分單體及其金屬配合物對耐藥菌株抗菌活性的研究較少。在提取魚腥草中槲皮素及合成槲皮素金屬配合物的試驗基礎上，本試驗選擇臨床上常見的致病菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱SA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，簡稱PA)的標準菌株和耐藥菌株研究槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性，以期為開發槲皮素提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品 魚腥草活性成分槲皮素單體，槲皮素-Zn(鋅)、槲皮素-Mn(錳)、槲皮素-Cu(銅)、槲皮素-Fe(鐵)、槲皮素-Mg(鎂)等金屬配合物，均由黃河科技學院化學實驗室郝紅英副教授所在課題組提供。

1.1.2 菌種 銅綠假單胞菌[美國模式培養物集存庫(ATCC)保藏編號：ATCC27853]、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由筆者所在實驗室保存。銅綠假單胞菌耐藥菌株、金黃色葡萄球菌耐藥菌株由黃河科技學院醫學院附屬醫院提供。

1.1.3 試劑與儀器 M-H(A)培養基(即水解酪蛋白瓊脂培養基)、M-H(B)培養基(即水解酪蛋白肉湯培養基)、LB培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、二甲基亞砜(DMSO)，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。SW-CJ-1FD超凈工作臺，上海錦昱科學儀器有限公司；GH-500BC隔水恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器有限公司；DRAGONLAB微量移液槍，深圳良誼實驗室儀器有限公司。

1.2 方法

采用WHO(世界衛生組織)推薦的瓊脂稀釋法，通過測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，簡稱MIC)，評價槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性[8-10]。

1.2.1 藥液制備 分別稱取槲皮素單體及其金屬配合物各100 mg，置于EP(eppendorf)管中，再加入二甲基亞砜(DMSO)2 mL，輕輕振搖，使得藥物充分溶解，配制成濃度為 50 mg/mL 的原液，將原液分別用DMSO等倍稀釋成濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL的藥液。放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌液制備 分別將SA和PA的標準菌株、耐藥菌株接種在LB培養基上，于37 ℃溫箱培養18～24 h。再將培養良好的上述細菌在無菌條件下接種至M-H肉湯培養基中，于37 ℃溫箱培養4～6 h，將增菌后的菌液用生理鹽水校正濃度至1.5×108CFU/mL，再用MH肉湯將菌懸液進行 1 ∶1 000 稀釋后備用，含菌量約為105CFU/mL。

1.2.3 抑菌試驗 配制M-H(A)培養基，并分裝于試管中，將培養基進行高壓蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)，然后將培養基置于70 ℃恒溫水浴箱中備用。在超凈臺中將M-H(A)培養基倒入無菌塑料培養皿中，加入已制備好的各濃度藥液，充分混勻，靜置凝固成含藥平板，使藥物的終濃度為5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17、0.08 mg/mL，DMSO的體積分數為10%。同時設空白對照和溶劑對照平板。每種濃度的藥物和對照均設3次重復。在超凈臺中，取2 μL已制備好的菌液，點接種于含藥平板上的相應位置，標記后置于37 ℃溫箱內培養18 h。然后通過無菌操作在細菌接種點處加10 μL 0.5% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑，置于37 ℃溫箱中培養2～4 h后觀察結果。

1.2.4 結果判定和處理 觀察平板中細菌接種處的菌落顏色變化，細菌接種點顯示紅色，表示細菌生長，記錄為“+”；細菌接種點不顯示紅色，表示細菌未生長，記錄為“-”。細菌未生長時的最小藥物濃度即為該藥物對該細菌的最小抑菌濃度，計算重復試驗MIC的平均值。數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理分析。

2 結果與分析

TTC是一種活菌染料，活細菌中的琥珀酸脫氫酶能將TTC還原成紅色的甲瓚(Formazan)，從而使培養物呈現紅色，而死細菌則為無色，因此細菌培養物顯示紅色表示有細菌生長，反之則表示無細菌生長。經試驗測定，空白對照和DMSO溶劑對照中的4種菌株接種點處均顯示紅色，說明空白對照平板和溶劑對照平板上4種菌株生長良好，10% DMSO對4種菌株生長無任何影響，藥物濃度是影響細菌生長的因素之一。MIC是細菌未生長時的最小藥物濃度，MIC值越小，說明藥物的抑菌作用越強。

2.1 對SA的抗菌活性

由表1、圖1可以看出，對于SA標準菌株ATCC25923，槲皮素單體的MIC為1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.31、3.75、5.00、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于 5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強于槲皮素單體(P<0.01)，而槲皮素-Mn(P<0.05)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

表1 槲皮素及其金屬配合物的最小抑菌濃度

注：“*”表示與槲皮素組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與槲皮素組相比差異極顯著(P<0.01)。

由表1、圖2可以看出，對于SA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.94、3.75、3.75、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于5 mg/mL。槲皮素-Zn和槲皮素單體的抑菌作用相當，而槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

2.2 對PA的抗菌活性

對于PA標準菌株ATCC25893，槲皮素單體的MIC為 0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.47、5.00、1.88、1.88、0.94 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強于槲皮素單體(P<0.05)，槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.05)、槲皮素-Mg(P<0.05)的抑菌活性弱于槲皮素單體，槲皮素-Fe和槲皮素單體的抑菌活性相當(表1和圖3)。

對于PA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為 1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.63、1.88、5.00、5.00、5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強于槲皮素單體(P<0.01)，槲皮素-Mn和槲皮素單體的抑菌活性相當，槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe(P<0.01)的抑菌活性弱于槲皮素單體(表1和圖4)。

3 討論與結論

SA為革蘭氏陽性菌(G+)，是引起化膿性感染(如毛囊炎、肺炎、膿毒癥、敗血癥等)的常見致病菌之一[11]。PA為革蘭氏陰性菌(G-)，是引起醫院感染的重要條件致病菌之一。近年來，隨著抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性問題愈加突出，如耐藥性SA、耐藥性PA，這些耐藥菌感染對人體健康都構成了極大威脅[12-13]。中草藥因為具有不良反應小、資源豐富、價格低廉、作用靶位多、不易產生耐藥性等特點而受到越來越多的關注。作為魚腥草有效成分之一的槲皮素，具有多種生物活性，其作為金屬離子螯合配體也一直倍受關注[7]。本試驗研究了槲皮素單體及其5種金屬配合物對SA和PA的質控菌株、耐藥菌株的抗菌活性。

通過研究發現，槲皮素、槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe對SA、PA的標準菌株和耐藥菌株均有抗菌活性。其中，槲皮素-Zn的抗菌活性強于槲皮素單體，而其他金屬配合物的抗菌活性要弱于槲皮素。對于SA標準菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強，其MIC為 0.31 mg/mL，其他抗菌活性強弱順序為槲皮素、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe；對于PA標準菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強，其MIC為0.47 mg/mL，其他抗菌活性強弱順序為槲皮素、槲皮素-Fe、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Mn；對于SA耐藥菌株，槲皮素-Zn和槲皮素抑菌活性相當，而其他金屬配合物要弱于槲皮素；對于PA耐藥菌株，槲皮素-Zn的抑菌活性要強于槲皮素，槲皮素-Mn和槲皮素的抑菌活性相當，其他金屬配合物弱于槲皮素。本研究結果顯示，槲皮素及其金屬配合物可以抑制SA、PA的標準菌株和耐藥菌株生長，從而為臨床治療耐藥菌感染提供了試驗基礎，也為進一步開發利用槲皮素提供了理論依據。