百宜黑雞PRLR基因多態性對產蛋性能的影響

吳松成， 韓 雪， 陳 林， 伍革民， 粟朝芝， 朱麗莉， 陶宇航

(1.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005； 2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽貴州 550025)

催乳素(prolactin，PRL)是由腺垂體催乳素細胞合成和分泌的一種肽類激素，主要作用于動物的性腺和乳腺，催乳素與其受體(prolactin receptor，PRLR)結合后作用于靶細胞，調節繁殖相關激素的分泌，促進基因表達[1-3]。利用PRLR基因的作用機制，將其作為影響動物繁殖性能的候選基因有著重要意義。近年來，越來越多的研究者對催乳素受體基因進行大量報道，劉遠等報道，PRLR基因的優勢基因型個體能夠顯著提高大白豬的窩產仔數[4]；張陳華等研究指出，PRLR基因的多態性對圩豬和定遠豬的產仔數有一定影響[5]；Tomas等發現，PRLR基因外顯子突變能夠顯著影響豬的排卵率和仔豬存活率[6]；Chu等認為，PRLR基因與羊的產羔數相關[7-8]。但是以上的研究均是對家畜的研究報道，對于家禽的研究甚少。洪坤月報道，PRLR基因多態性對雞的早期平均蛋質量有一定的影響，而對開產日齡、蛋型指數、早期產蛋量等影響不顯著(P>0.05)[9]。百宜黑雞是貴州省的優良地方品種，但由于近年來外來品種的引進，加之農戶的粗放型飼養，人為因素過強地干預選育，百宜黑雞品種資源岌岌可危。本試驗以百宜黑雞為研究對象，以期尋找有效的分子遺傳標記，為該品種進一步的開發利用、保種等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

百宜黑雞由貴州省貴陽市烏當區百宜鄉貴州農農農生態農業開發有限公司的種雞場提供。隨機抽取同一日齡、相同飼養管理水平的95羽百宜黑雞雞翅靜脈采血5 mL/羽，EDTA抗凝，放冰盒帶回實驗室，-20 ℃冰箱保存備用，用于基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 試驗采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]分別對95羽百宜黑雞血液中基因組DNA抽提，并用Thermo Fisher微量紫外分光光度計對所獲得的DNA進行濃度和純度測定，1.0% 瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 根據GenBank發布的家雞PRLR基因序列(登錄號：NC_006127.4)，利用引物設計軟件Primer 5.0對雞PRLR基因設計2對特異性引物，分別對外顯子3(PRLR-1)和外顯子6(PRLR-2)進行擴增，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，引物信息見表1。PCR擴增反應采用30 μL體系：上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix 14 μL，雙蒸水9 μL。反應程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性40 s，退火35 s(退火溫度詳見表1)，72 ℃延伸40 s，32個循環；72 ℃終延伸10 min。

表1 百宜黑雞PRLR基因擴增引物詳細信息

1.3 數據處理

利用Excel 2007對數據進行分類統計，DNAstar進行序列分析比對，用SPSS 18.0中GLM模型對不同基因型與產蛋性能間的關聯性進行相關分析，結果以“平均值±標準差”體現。

2 結果與分析

2.1 PCR產物檢測

以百宜黑雞基因組DNA為模板，分別對2對引物進行PCR擴增，產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，結果發現，目的條帶與預期結果一致，且引物特異性良好，PCR產物無須純化可直接用于測序(圖1)。

2.2 PCR產物測序及序列分析

根據目的片段擴增結果，將PCR產物全部送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行直接測序。測序結果經DNAstar拼接并與GenBank發布的家雞PRLR基因序列進行校正、比對，結果在試驗群體的PRLR基因中發現只存在1個SNP位點(圖2)，在百宜黑雞PRLR基因外顯子3的36 bp位置發生了C/T突變(36C/T)，然而外顯子6區域并未找到突變位點。

2.3 百宜黑雞PRLR基因遺傳特性分析

測序結果經序列對比發現，在試驗群體的PRLR基因中找到了1個SNP，根據這個SNP位點將其對應的純合子和雜合子命名為CC型和CT型。根據表2統計的結果可知，該位點對應的基因型CC基因型為優勢基因型(0.957 9)，等位基因C為優勢等位基因(0.978 9)。χ2適合性檢驗表明，該基因座的位點不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P<0.05)；PIC=0.041 7<0.25，屬于低度多態。

表2 百宜黑雞PRLR基因多態位點基因型頻率及等位基因頻率

2.4 PRLR基因與產蛋性能關聯分析

根據SNP分型的結果，對不同基因型與產蛋性能間的關聯性進行分析，百宜黑雞PRLR基因36C/T位點與產蛋性能的顯著性關系分析結果如表3所示，由表3可知，任何一種基因型與總蛋個數以及蛋均質量之間均不呈顯著關系(P>0.05)。

表3 PRLR基因多態位點與肉質性狀關聯分析

3 討論與結論

由于生產性能直接決定著經濟效益，因此對養殖戶或者育種家來說，在追求動物快速增長的同時更加注重其生產性能。王健等研究表明，鵝PRLR基因的表達受PRL基因的調控[10]；高天等研究表明，PRLR基因多態性極顯著影響嘉興黑豬的總產仔數、產活仔數、死胎數和初生均質量(P<0.01)[11]；孫延曉等研究發現，PRLR基因對豬的平均窩產數有影響[12]；洪月坤報道，PRLR基因外顯子3多態性對雞的產蛋性能無影響[9]。由此可見，不同的物種或品種得出的結論是不一致的。本研究以百宜黑雞為研究對象，在試驗群體的PRLR基因的外顯子3發現了1個SNP，χ2適合性檢驗表明，該基因座的位點不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P<0.05)，這可能是抽樣誤差、樣本數較少造成的，也有可能是人工過度選育結果所致。將該突變位點與總蛋數和平均蛋質量進行顯著性分析發現，該位點的任何一種基因型對這2項生產數據均不顯著，這一結果與前人研究結果[9]有一定的相似之處，但尚不清楚是品種原因還是基因特性，因此，筆者所在課題組今后將會加大樣本數量和雞品種進行進一步驗證。本試驗結果為后期原核或真核表達載體的構建提供了理論依據，對百宜黑雞品種的開發利用、保種選育提供了理論資料。