4個貴州烏骨雞群體遺傳關系的微衛星標記分析

伍革民， 張 繼， 唐繼高

(1.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005； 2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550000)

貴州省地方雞種資源豐富，其中赤水烏骨雞等7個品種已編入《貴州省畜禽品種志》，還有一些地方雞種如普安烏骨雞、水西烏骨雞等群體尚未編入，由于地理、環境等各種因素，它們缺乏規模化飼養、品種資源保護利用和開發研究。普安縣烏骨雞主產于云貴高原中段的貴州省西南部烏蒙山區普安縣新店鄉等地，歷史上無記載，是一種獨特的烏骨雞品種，有黑羽、麻羽等羽色類型，黑羽烏骨雞基本是農戶散養，缺少專業化飼養和規模化養殖[1]。水西烏骨雞主要產于貴州省黔西縣新仁鄉等地，養殖歷史較長，該烏骨雞體格健壯，對疾病的抵抗能力強，常年以青菜、統糠、稻谷等為食，耐粗飼，喜食山坡草籽、昆蟲，覓食能力強，皮、骨、肉及內臟為烏色，肉質鮮美。為充分開展這些地方雞種資源的保護和利用，有必要了解它們的遺傳結構和親緣關系。在應用于遺傳結構或親緣關系檢測的多態性標記中，微衛星標記數量多，研究成熟、分布廣、共顯性、易于檢測，因而應用廣泛。本研究選擇7個微衛星標記對普安烏骨雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞的遺傳多樣性進行檢測，并分析飼養于貴州省的4個烏骨雞群體間的遺傳關系，可為這些品種或群體的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用的4個雞品種為普安烏骨雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞，其中普安烏骨雞、赤水烏骨雞和水西烏骨雞是貴州省本地長期飼養和培育的地方雞種，廣西烏骨雞從廣西壯族自治區東蘭縣引進，后在貴州長期飼養。每個品種樣本數為30羽，采用翅下靜脈采血1.0～1.5 mL/羽，-20 ℃保存。

參考國內外文獻報道[2～7]，選擇位點分布多的7對微衛星標記。引物位置、退火溫度及序列等信息見表1。

1.2 方法

采用血液DNA提取試劑盒提取DNA。20 μL PCR反應體系包括2×TaqPCR MasterMix 10 μL、引物各1 μL、100 ng/μL 模板DNA 1 μL、去離子水7 μL。PCR反應程序：94 ℃預熱3 min后進行35個PCR循環，然后72 ℃延伸 5 min。35個PCR循環參數包括95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s。1.0%～1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果，8%～10%聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產物，銀染顯色和凝膠成像照相保存，使用Labworks軟件分析片段大小并進行分型。

1.3 數據統計分析

1.3.1 群體內遺傳多樣性分析 等位基因數、有效等位基因數、等位基因頻率、觀測和期望雜合度、種群近交系數等遺傳多樣性指標使用PopGen 3.2軟件進行統計和分析。多態信息含量(polymorphism information content，PIC)根據以下公式計算：

表1 7對微衛星引物信息

式中：n為等位基因數；Pi和Pj分別為群體中第i個和第j個等位基因頻率。

1.3.2 群體間遺傳關系分析 根據等位基因頻率，利用PopGen 3.2軟件計算4個群體之間的遺傳距離，構建4個烏骨雞群體系統發生樹。

2 結果與分析

2.1 微衛星DNA多態性檢測結果

7個微衛星標記(MCW0005、MCW035、MCW0166、LEI0217、LEI0089、ADL16、ADL201)分別檢測出5、4、3、4、6、6、4個等位基因。等位基因頻率見表2。

表2 4個烏骨雞雞群體等位基因頻率

2.2 群體內遺傳多樣性

4個烏骨雞群體7個微衛星座位平均基因雜合度(H)和多態信息含量(PIC)見表3。

從表3可知，試驗用的4個雞群體在7個微衛星基因座均表現出較高的基因雜合度，各群體平均雜合度為0.727 2(0.706 9～0.738 5)，其中雜合度最高的是赤水烏骨雞的ADL166座位，為0.802 8。在4個烏骨雞群體中，各基因座群體雜合度和多態信息含量均大于0.50，說明7個微衛星基因座在這些雞群體中遺傳變異幅度較大。不同基因座在不同群體中雜合度和多態信息含量存在差異，其中廣西烏骨雞多態信息含量和雜合度最高。

表3 4個烏骨雞雞群體7個微衛星座位的雜合度和多態信息含量

2.3 群體間遺傳關系

4個烏骨雞群體間的遺傳距離見表4。由表4可知，4個雞群體遺傳距離均較近，在0.05以下，其中廣西烏骨雞和水西烏骨雞之間的遺傳距離最遠，為 0.044 8，與赤水烏骨雞的遺傳距離最近，為0.019 4。

表4 4個烏骨雞群體之間的標準遺傳距離(Ds)

根據Nei氏標準遺傳距離[8]，應用PopGen 3.2軟件中的UPGMA程序構建的系統發生樹，結果見圖1。從圖1可知，4個雞群體可以分為三大類：水西烏骨雞聚為一類，普安烏骨雞聚為一類，赤水烏骨雞和廣西烏骨雞聚為一類。

3 討論與結論

3.1 微衛星DNA多態性與群體內遺傳多樣性

為準確說明一個群體或品種的遺傳多樣性水平，應選用在該群體內多態性含量高的基因座位進行檢測和分析。采用多態信息含量(PIC)來衡量基因座多態性情況，當PIC>0.5時，該座位高度多態。本研究中用于多樣性分析的7個微衛星座位在所有5個群體中的多態信息含量均在0.5以上，因此本試驗的結果具有一定的參考價值。采用雜合度來評估群體內遺傳變異程度，本研究中的4個烏骨雞群體的7個微衛星座位的平均雜合度在0.706 9～0.738 5，均在 0.70 以上，說明4個烏骨雞群體遺傳多樣性豐富，同時也說明在利用與推廣這些地方群體時，還必須對其進行進一步純繁選育。上述雞養殖方式基本為散養，缺乏系統選育，說明研究結果與實際情況相符。

3.2 群體間遺傳關系

赤水烏骨雞主產于貴州省赤水市，又名竹鄉雞，屬于蛋肉兼用型地方品種[9-10]；普安烏骨雞主產于貴州省西南部烏蒙山區普安縣新店鄉等地，歷史上無記載，是一種獨特的烏骨雞品種；水西烏雞主產于黔西縣新仁鄉，養殖歷史悠久；普安烏骨雞和水西烏雞均未入《貴州省品種志》，很少開展資源保護評價和開發利用；廣西烏骨雞從廣西壯族自治區東蘭縣引進，后在貴州長期飼養。從本研究根據遺傳距離對上述4個烏骨雞群體構建的系統發生樹來看，廣西烏骨雞與赤水烏骨雞遺傳距離近，聚為一類，可能與這2個雞種進化及育種歷史相似、均屬于蛋肉兼用型烏骨雞品種有關。水西烏骨雞與普安烏骨雞各自聚為一類，可能是地理、氣候等因素造成的。上述4個烏骨雞群體之間的遺傳距離較小，均在 0.05 以下，這可能與它們均屬于烏骨雞有關。