大葉蒲公英耐鹽突變體的篩選與植株再生

劉艷芬， 王秀萍， 陳翠果， 梁偉玲， 王婷婷

(1.河北工程大學園林與生態學院，河北邯鄲 056021； 2.唐山市植物耐鹽研究重點實驗室/河北省農林科學院濱海農業研究所，河北唐山 063200)

鹽害是影響作物產量的一種主要的非生物逆境危害，土壤的鹽漬化已成為限制我國農業發展的主要因素。如何開發利用鹽堿地，以增加有效可耕地面積、提高作物產量，已成為當前農業學科研究的重要任務之一。目前，培育耐鹽作物品種、提高作物耐鹽性，已成為開發利用鹽堿地、提高經濟產量最根本和最有效的方法[1]。已有研究表明，在鹽漬化土壤和海水或咸水脅迫下生長的植物，能夠更多地積累營養元素和活性物質，具有更好的營養、藥用和其他經濟品質，這使得通過各種途徑篩選培育多樣化的耐鹽經濟植物更具有必要性[2]。

通過組織培養獲得愈傷組織的耐鹽突變體，進而培育出耐鹽的品種或品系，是蒲公英生物技術抗性育種的研究方向之一。蒲公英(Taraxacummongolicum)是對菊科蒲公英屬植物的通稱，種類繁多。一些生長在鹽漬環境中的蒲公英種類生物量小，難以在鹽堿地區獲得高產[2]。大葉蒲公英是野生蒲公英的四倍體變異體，其營養價值、醫療價值和經濟價值都較高，而且生物量大，是有待推廣的新品種，但其耐鹽性卻較弱。本研究以大葉蒲公英葉片為外植體，通過鹽脅迫處理，從愈傷組織中誘導產生耐鹽突變體，進而誘導突變的愈傷組織再生成完整植株，旨在為蒲公英的耐鹽育種和快速高效的離體再生體系提供依據，也為更好地開發和利用蒲公英奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為大葉蒲公英葉片。將大葉蒲公英種子盆栽播種，剪取生長20～30 d的幼葉作外植體誘導愈傷組織，篩選耐鹽突變體后，誘導形成不定芽與不定根，獲得再生植株。

1.2 方法

1.2.1 大葉蒲公英愈傷組織耐鹽突變體的獲得

1.2.1.1 愈傷組織誘導培養基的篩選 將大葉蒲公英葉片剪成1 cm2左右的小塊，常規消毒后，將外植體分別接種到不同誘導培養基上，接種45 d后統計各處理愈傷組織的發生率和生長狀況。誘導培養基設5個處理：處理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；處理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；處理3，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA；處理4，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D；處理5，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.06 mg/L 2，4-D。

1.2.1.2 耐鹽愈傷組織突變體的篩選與鑒定 將繼代5次的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊，分別接種于附加NaCl含量為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%的繼代培養基上，進行鹽脅迫處理，從中選出愈傷組織耐鹽突變體，轉入無鹽和耐鹽培養基上交替培養2次，再將其轉到無鹽繼代培養基上擴增培養2個月。將篩選出的突變愈傷組織與對照進行隨機擴增多態性DNA(RAPD)檢測。

1.2.2 蒲公英耐鹽突變體的植株再生

1.2.2.1 耐鹽突變體不定芽的誘導 將多次繼代的耐鹽愈傷組織突變體轉接到不同的不定芽誘導培養基上，根據不定芽發生狀況，篩選出適合的不定芽誘導培養基。處理1：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理2：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理3：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；處理4：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；處理5：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；處理6：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA。

1.2.2.2 耐鹽突變體不定根的誘導 將耐鹽突變體的不定芽叢經過多次繼代，獲得較多數量的不定芽，此時不定芽嫩弱，不利于生根。轉入不含生長調節劑的壯苗培養基繼代 1～2次。之后將不定芽剪切成最小芽叢，轉接到含有不同生長素的生根培養基中進行生根誘導。誘導20 d后，根據不定根的發生狀況，選出適合的生根培養基配方。對照：1/2MS(不含生長條件物質)；處理1：1/2MS+0.1 mg/L IBA；處理2：1/2MS+0.3 mg/L IBA；處理3：1/2MS+0.1 mg/L NAA；處理4：1/2MS+0.3 mg/L NAA。在整個組織培養過程中，如無特殊情況說明，培養條件如下：溫度(23±2) ℃，每天光照16 h，光照度 2 500 lx。培養基中含瓊脂5.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。

2 結果與分析

2.1 大葉蒲公英愈傷組織耐鹽突變體的獲得

2.1.1 愈傷組織誘導培養基的確定 在不含2，4-D的培養基中，愈傷組織發生率較低，面積小，質地緊湊。隨著 2，4-D 濃度的增加，愈傷組織的發生率逐漸提高，且愈傷組織面積逐漸變大。但是在處理5中的愈傷組織質地變得疏松，不利于繼代培養，這可能與2，4-D濃度過高有關(表1)。因此，選擇處理4，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D 作為愈傷組織誘導的合適培養基(圖1)。從愈傷組織分布來看，葉片切塊的部位不同，愈傷組織的發生量有所不同，含葉脈的比不含葉脈的切塊產生的愈傷組織面積大，形成速度快。因此，盡量切取葉脈附近的葉片作為外植體，以獲得更多的愈傷組織。

表1 大葉蒲公英葉片外植體在不同誘導培養基上愈傷組織發生情況

2.1.2 愈傷組織耐鹽突變體的獲得 將初代培養的蒲公英愈傷組織在原誘導培養基上繼代多次后，愈傷組織變得松散，于是將其繼代于降低了2，4-D濃度的培養基上，根據愈傷組織生長狀況和增殖率，確定了培養基配方為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。在此繼代培養基上，愈傷組織的生長速度快，質地結構適中。

愈傷組織接種在上述繼代培養基上，分別附加NaCl含量為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%、2.0%進行鹽脅迫培養。1周后愈傷組織開始變褐，2周至3周后逐漸死亡，4周后絕大部分愈傷組織變褐死亡，但在個別的愈傷組織內部，發現有黃綠色的愈傷組織存活(圖2)。NaCl含量為 2.0% 的愈傷組織全部死亡。將存活愈傷組織接種到含有相應NaCl濃度的培養基上繼續耐鹽培養，每3周繼代1次，耐鹽繼代4次后，轉入含0%和2%NaCl培養基上交替培養2次。之后在無鹽培養基上增殖，獲得了更多的耐鹽愈傷組織。

將對照與NaCl含量分別為0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%(代號分別為CK、y0、y1、y2、y3、y4、y5、y6)的耐鹽愈傷組織進行RAPD檢測，確定突變體。共采用15條隨機引物對耐鹽突變體和對照進行RAPD分析，隨機引物分別是S36、S224、S262、S267、S308、S358、OPA-19、OPC-05、OPD-05、OPG-06、SJ14、OPC-11、OPB-12、S90、S309。由圖3可以看出，S358引物對6號(1.2% NaCl)、OPA-19引物對5號(1.0% NaCl)、OPC-05引物對4號(0.8% NaCl)愈傷組織均擴增出了與對照不同的差異條帶。因此可見，NaCl含量為0.8%、1.0%、1.2%的培養基上存活下來的愈傷組織遺傳物質均發生了變異，本次鹽脅迫獲得的蒲公英耐鹽愈傷組織為耐鹽突變體。

2.2 蒲公英耐鹽突變體的植株再生

2.2.1 耐鹽愈傷組織不定芽的誘導 研究發現，不同種類和濃度的生長調節物質組合對于愈傷組織不定芽的發生有重要影響(表2)。愈傷組織在較高濃度6-BA(處理3、處理6)的培養基上，不定芽發生數量較多，但葉片較細小，甚至有玻璃化發生。在較低濃度6-BA(處理1、處理4)培養基上，不定芽發生數量較少。處理3、處理6、處理2的不定芽增殖率與其他處理有顯著差異，三者之間差異不顯著，但處理2，即培養基配方為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA的不定芽生長健壯，有利于不定芽的繼續增殖和生根培養，選擇此培養基作為耐鹽愈傷組織生成不定芽的最適培養基(圖4)。

表2 不同生長調節物組合的培養基上不定芽生長狀況

注：同列數據后標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。增殖率=繼代后的不定芽總數/原不定芽數。

2.2.2 耐鹽愈傷組織不定根的誘導 研究發現，可將增殖的不定芽在生根之前先轉入無激素的MS培養基上壯苗(圖5)。生根誘導20 d后，在不含生長素的對照培養基中，也有不定根發生，但是生根率低，根系生長慢(表3)。隨著NAA濃度的提高，生根率明顯提高，但是NAA濃度為0.3 mg/L與 0.5 mg/L 的生根率較為接近，雖然前者不定根均長略短，但平均根數較多，利于移栽成活。單獨添加IBA的生根效果沒有單獨添加NAA的效果好。因此，選擇處理3，即配方為 1/2MS+0.3 mg/L NAA作為蒲公英耐鹽愈傷組織的最適生根培養基(圖6、圖7)。

表3 不同生長調節物質組合培養基上的不定芽生根狀況

3 結論與討論

3.1 結論

為獲得大葉蒲公英耐鹽突變體再生植株，本試驗以其葉片為外植體，將誘導出的愈傷組織經過不同濃度耐鹽脅迫處理，經過篩選與RAPD檢測，確定獲得了相應鹽濃度(NaCl含量分別為0.8%、1.0%、1.2%)的耐鹽愈傷組織突變體。再通過分別誘導突變愈傷組織形成不定芽和不定根，獲得耐鹽突變體的再生植株。結果發現，大葉蒲公英愈傷組織最適誘導培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D，耐鹽突變體不定芽發生的最適培養基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最適生根培養基為1/2MS+0.3 mg/L NAA。

3.2 討論

獲得耐鹽愈傷組織的方法一般有2種，一是將外植體直接接種到含鹽培養基上誘導耐鹽愈傷組織[3]；二是將普通的愈傷組織轉移到鹽濃度恒定[4-5]或逐次遞增[6-8]的培養基上，通過多次繼代，選出穩定生長的愈傷組織。將愈傷組織直接置于含有高于選擇濃度NaCl的誘導培養基上，雖然可減少形成生理適應細胞，但有可能淘汰某些本來可能存在的變異。張新果等將蒲公英愈傷組織直接繼代到含有1.5%NaCl的培養基上，獲得了12株耐1.5% NaCl的蒲公英再生植株，但對其有性后代的耐鹽性未作進一步研究[5]。本試驗將蒲公英葉片愈傷組織接種在鹽濃度遞增的誘導培養基上，篩選出了耐鹽的愈傷組織突變體。雖然這種方法容易產生生理適應的細胞或組織，但是本試驗結果表明，可以獲得不同濃度級別的蒲公英耐鹽愈傷組織變異系。

利用組織和細胞培養篩選耐鹽性突變體植株，雖然在我國已取得了較大進展，但仍存在一些問題需要解決[9-10]。如部分植物的愈傷組織或細胞系的耐鹽性和再生植株的耐鹽性表現并非完全一致、耐鹽系難以分化成再生植株、耐鹽突變體植株農藝性狀的改變等。目前，筆者將不同耐鹽級別的愈傷組織突變體再生出完整植株移栽入大田，并已開花結實。下一步將進行田間的耐鹽性鑒定，直接鑒定耐鹽變異體的耐鹽程度和變異穩定性。