基于線粒體nad1 intron 2序列的金釵石斛和混淆品親緣關系及DNA條形碼研究

丁 鴿， 張代臻， 丁小余， 蔡照勝， 商士斌

(1.鹽城工學院化學化工學院，江蘇鹽城 224003； 2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046； 3.江蘇省灘涂生物資源與環境保護重點建設實驗室，江蘇鹽城 224002； 4.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，江蘇南京 210042)

石斛是我國蘭科石斛屬(Dendrobium)的珍稀瀕危物種，主要分布于我國植物區系學上的熱點地區“嶺南地區”和“華中地區”[1]，長于海拔800～1 600 m的懸崖巖石或樹干上。石斛屬為蘭科第2大屬，在我國共有74種和2個變種[2]。獨特的生境造就了石斛藥材的非凡品質，早在《神農本草經》中石斛藥材就被列為上品，應用歷史悠久，具有養陰生津、潤肺明目、抗癌防老等功效[3]。金釵石斛是《中華人民共和國藥典》(2005版)[4]收錄的適合加工成藥材的5種石斛之一，由于相似的外形及組織結構，其他許多同屬植物及金石斛屬、石仙桃屬的植物在加工后被用于冒充石斛正品在市場出售[5-6]。準確鑒定石斛種類是保證藥材質量和藥理活性研究的重要前提，對于瀕危物種的資源保護也具有重要意義。

nad1基因編碼線粒體呼吸傳遞鏈的復合體Ⅰ-泛醌氧化還原酶(也可稱NADH脫氫酶)的nad1亞基，是1個結構較為穩定的線粒體基因，由5個外顯子構成[7]，依次是nad1/a～nad1/e。nad1基因的內含子2序列位于nad1/b和nad1/c之間，可能與mRNA成熟的反式剪接機制有關。植物線粒體中許多基因存在進化較快的內含子，加上被子植物線粒體是母系遺傳，因此線粒體DNA片段信息同樣提供了重要的進化信息，在植物系統發育重建、居群生物學和生物地理學研究中有許多成功的報道[2，8-9]。SNP(single nucleotide polymorphism)稱為單核苷酸多態性，是指在染色體基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式[10]。SNP具有位點豐富、更高的遺傳穩定性、易實現分析的自動化等特點[11-12]，廣泛地應用于疾病檢測、分子育種及中藥材鑒別等領域[13-15]。

AS-PCR，即位點特異性PCR，首次利用是DeSalle等在Nature上發表的對魚子醬中魚卵所屬鱘魚的種類進行鑒別[16]。在中藥材鑒定領域，有姜黃、大黃、齒瓣石斛、鐵皮石斛等的位點特異性鑒別研究[17-20]。DNA序列分析是常用于植物分子系統學研究的一類重要的分子標記，它是通過比較DNA序列的差異來反映生物體在遺傳上的差異，在此基礎上發展起來DNA barcoding(DNA條形碼)技術，被越來越多地應用于中藥材鑒定的研究中。DNA條形碼是基于DNA片段來表征生物物種身份并且有足夠變異位點同時容易擴增的技術[2，21]，已經在人參、金銀花、石斛等中藥材基原植物的鑒定中得到廣泛應用[22-25]。本研究擬對金釵石斛及其近緣物種的nad1基因內含子2序列進行研究，確定該序列作為DNA條形碼的可行性并尋找SNP分子標記，研究基因片段在植物鑒定方面的應用并探討金釵石斛的進化地位，為瀕危物種的保護生物學研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用材料主要采自云南、廣西、廣東等地，各種植物的種類、來源及GenBank登錄號詳見表1。

1.2 基因組DNA提取

取硅膠干燥的材料葉片0.1 g，用無菌水沖洗干凈，采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[26]提取葉片總DNA。利用紫外分光光度計測定所提取的DNA模板質量，評價其DNA濃度及純度，于-20 ℃保存。

表1 供試材料來源及登錄號

1.3 引物設計及PCR擴增

引物根據Zhang等對石斛屬植物的研究[27]設計，序列如下：nad1 F，5′- GCATTACGATCTGCAGCTCA-3′；nad1 R，5 ′-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3′。PCR擴增反應在 30 μL 的反應體系中進行，包括10 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶，200 mmol/L dNTPs，各10 pmol/L 引物，DNA模板約80 ng。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR反應產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 PCR產物純化與測序

PCR產物用美國Axygen試劑盒純化，純化產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 DNA序列分析

所得石斛屬植物的序列用Clustal X 1.8軟件完成比對，用Mega 5.0軟件分析堿基組成、變異位點數、簡約信息位點數、轉換和顛換數。以Kimura-2參數計算遺傳距離，以牛齒蘭(Appendiculacornuta)為外類群，分析植物的種間變異，構建UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，非加權組平均法)系統發生樹，分析石斛屬各物種的親緣關系。

1.6 位點特異性引物設計及擴增

運用Clustal X1.8、Mega 5.0軟件對所得序列進行排列，根據堿基位點的變異設計特異性引物，對金釵石斛及其混淆品進行鑒別。擴增反應的引物序列如下：JCF，5′-CTAAACGA-CGAGCAAACACT-3′；JCR，5′-AATTTCTG-CGCCCTAAGAAGC-3′。30 μL的反應體系包括3 μL 10×PCR buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 2 mmol/L dNTPs，1 UTaq酶 ，1 μL 10 pmol/L 引物，100 ng DNA模板。反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30個循環；72 ℃延伸7 min。

2 結果與分析

2.1 nad1 intron 2序列的長度和變異

金釵石斛及其近緣物種(不含外類群)的nad1intron2序列長度為774～852 bp，長度變異較大，其中金釵石斛的nad1內含子2序列長度為843 bp。經Clustal X 1.8和MEGA 5.0軟件排序，簡并序列長度為871 bp。其中堿基組成平均含量T為18.2%、C為25.6%、A為25.8%、G為30.4%，GC含量為56%，GC含量明顯高于AT含量，其中金釵石斛GC含量為55.8%，各樣本的序列長度及堿基含量見表2。

表2 金釵石斛及混淆品nad1 intron 2序列長度及堿基組成

15種石斛有保守位點817個，變異位點27個，簡約信息位點5個，單變異位點22個。共有6處indels(堿基缺失)，其中較長的indels位于349～417、579～596 bp，不同的物種表現出缺失堿基的長度和位置的差異；較短的indels位于 140～146、445～451、522～528、610～613 bp，最大的長6 bp，最小的長4 bp。

2.2 基于SNP的金釵石斛的鑒別

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。金釵石斛與其混淆品之間存在22個SNP位點，可以用于物種之間的鑒別。在獲得的15種石斛的nad1intron2序列中，金釵石斛在第603位上的堿基為T，其他種類均為C，該位點可以作為金釵石斛與其混淆品的種間鑒別的有效位點。根據特異性位點設計的引物用于石斛植物的擴增，結果顯示，只有在金釵石斛中產生了大約400 bp長度的單一條帶，說明該變異性引物用于物種鑒定的可行性。

2.3 遺傳距離的計算及基于DNA barcoding的石斛屬親緣關系分析

應用MEGA 5.0進行序列分析，以Kimura-2參數計算各物種之間的遺傳距離，結果見表3。從遺傳距離來看，鐵皮石斛與黃花石斛遺傳距離差異最小，為0，而兜唇石斛與齒瓣石斛的差異最大，為0.010，平均遺傳距離為0.004。外類群牛齒蘭與15種石斛的遺傳距離為0.147～0.156。利用MEGA 5.0軟件對獲得的序列片段進行分析，構建序列進化UPGMA樹(圖1)。UPGMA樹分析發現，矮石斛、報春石斛、黃花石斛、鐵皮石斛首先聚為1支，然后與玫瑰石斛、粉花石斛、細葉石斛、流蘇石斛、束花石斛形成的分支聚為1支，最后與晶帽石斛、球花石斛、金釵石斛、兜唇石斛、齒瓣石斛依次聚類，形成與牛齒蘭并列的2個大支?？梢钥闯?，nad1intron2序列可以對石斛種類進行有效的鑒別，適宜作為分子條形碼用于金釵石斛及其近緣物種的親緣關系分析。

表3 基于nad1 intron 2序列的石斛屬及牛齒蘭遺傳距離分析

注：物種編號同表1。

3 討論與結論

DNA是植物細胞的遺傳物質，具有穩定、可靠、不受外界影響和可遺傳性等優點，可以作為藥用植物鑒別、植物分類及進化關系分析的依據[28-32]。線粒體基因含有較好的位點多樣性水平，基因重排對于近緣物種的鑒定具有較大的意義，在動物中廣泛應用于譜系地理、系統發育、DNA條形碼鑒定等研究[33-34]。而植物線粒體基因組遠大于動物線粒體基因組，變異幅度可能高達10倍以上，在同一科中也可能存在較大差異[35-36]。nad1intron2序列用于藥用植物的鑒別并有效地追溯其原產地[2，27]、稻族的系統發育及分析鑒定[37]、挪威云杉不同居群的遺傳關系分析[38]等研究，均取得了較好的效果。本試驗通過對15種石斛的研究發現，線粒體基因nad1intron2變異位點數量為27個，可用于金釵石斛及其混淆品的鑒別。

與其他分子標記相比，SNP具有位點豐富、檢驗成本低、更高的穩定性及檢出率高等優點，被廣泛應用于植物遺傳育種、物種鑒別及中藥材的鑒定研究中[15，39]。位點特異性鑒別PCR(allele-specific diagnostic polymerasechain reaction，簡稱AS-PCR)具有操作簡單、高效等特點，亦被廣泛應用于藥材及其混淆品、偽品的鑒別[6，15]。而線粒體基因序列中含有的SNP位點，方便結合AS-PCR等技術，更利于物種的鑒定。本研究中，存在于603位的SNP位點，可以成功地鑒別金釵石斛與其混淆品，為石斛屬植物的鑒別及其他中藥材的物種鑒定及規范中藥材市場提供理論依據。

DNA barcoding是2003年由加拿大圭爾夫大學的Paul Hebert正式提出的，是利用1段短的、標準的DNA片段，從基因組標準化區間對物種進行快速、準確的鑒定[40]。DNA條形碼的優點包括不受樣品形態和發育階段限制、準確性高等，可以從分子層面構建物種的序列庫并快速有效地進行鑒別，可以促進物種的鑒定分類及保護生物學的發展，對新物種的發現和珍稀瀕危物種的保護具有重要的意義。本研究利用的基于線粒體nad1intron2序列的DNA條形碼技術，排除了植物形態等條件的限制，可以直接從分子水平對金釵石斛及其近緣物種進行鑒別，效果較好。研究過程中涉及的物種序列的GC含量、遺傳距離、UPGMA進化樹等結果，可為石斛的市場應用提供有效的鑒別方法，為石斛類藥材的鑒定提供了一種新的思路，也為找到更適合的藥用植物DNA條形碼，從而構建更完整的公共序列數據庫奠定基礎。