草金魚胚胎與胚后發育觀察

王 磊，施文瑞，宋東鎣，李學軍，樊云鵬，高興磊，張 紅

( 河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007 )

2017年中國漁業統計年鑒顯示我國淡水觀賞魚養殖量在2016年約4×109尾[1]。隨著現代社會人們生活水平的提高，越來越多的人開始關注觀賞魚市場，觀賞魚具有廣闊的市場前景。草金魚(Carassiusauratus)是我國傳統的觀賞魚養殖品種，俗稱紅鯽魚或金鯽魚，體形近似鯽魚(C.auratus)，屬魚綱、鯉形目、鯉科、鯽屬，具有很好的觀賞價值及經濟價值。目前有關草金魚的研究主要為不同因素對其生長發育的影響研究[2-3]、分子生物學研究[4]和體色研究[5-7]等，對草金魚的早期生活史的研究較少。本研究擬通過對草金魚的胚胎發育及胚后發育過程系統的觀察，對胚胎發育及胚后發育特征的拍照記錄，以期揭示草金魚早期發育的規律，從而為草金魚的人工繁殖和遺傳育種等工作提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 人工授精

2016年6月采用河南師范大學水產養殖基地的草金魚親魚，進行人工催產后獲得受精卵，受精卵置于水盆中的培養皿里進行孵化，孵化用水事先進行曝氣，水溫為(23±1) ℃。

1.2 幼魚培育

幼魚的培育在河南師范大學水產養殖基地的養殖桶中進行，初孵仔魚培育溫度為19～22 ℃。卵黃囊消失后，每日8：00將飼料用水捏成團，裝入料兜進行投喂。投喂期間，按照每日均有少量剩余為宜。每日8:00和17:00各換水1次，每次換水深度約10 cm，同時挑出死魚。

1.3 取樣和觀察

胚胎發育過程中，將受精卵至卵裂期觀察時間間隔設為0.083～0.17 h，囊胚期至器官形成期觀察間隔設為0.17～1 h，出膜前期至出膜期觀察間隔為2 h。每次取10粒受精卵，在加水培養皿中采用奧特連續變倍體視顯微鏡(SZ680T2L)對胚胎發育情況進行拍照記錄，以50%的個體出現新特征作為劃分發育時期的標準。

仔魚、稚魚及幼魚觀察：草金魚出膜后，每日20:00取樣10尾，觀察其外部形態變化，拍照并記錄其長度，直至鱗片完全長出。

2 結果與分析

2.1 胚胎發育

草金魚成熟卵子為黏性、圓形。草金魚受精卵(圖1a)在曝氣的自來水中進行孵化，水溫(23±1) ℃，約56.67 h后完成整個胚胎發育，開始進入胚后發育。草金魚的胚胎發育可分為胎盤期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期、肌節出現及尾泡期、器官形成期及出膜期(表1)。

2.1.1 胚盤期

成熟卵子呈淡黃綠色、圓形，卵質分布均勻。卵子受精后遇水膨脹，卵周間隙擴大。受精后1.13 h，原生質向動物極聚集，逐漸隆起形成胚盤(圖1b)。

表1 草金魚胚胎發育時程

2.1.2 卵裂期

受精后1.30 h，受精卵動物極胚盤中央出現分裂溝，胚盤分裂為相似的2個細胞，即2細胞期(圖1c)；受精后1.47 h，沿第一次分裂垂直的方向出現第二次卵裂，形成4個大小相同的細胞，即4細胞期(圖1d)；受精后1.57 h，胚盤進行第三次分裂，形成8個分裂球，進入8細胞期(圖1e)；1.80 h后進入16細胞期(圖1f)，2.30 h后進入32細胞期(圖1g)，受精后2.60 h，卵裂向多個方向進行，細胞數量逐漸增多，細胞越來越不規則，界面難以區分，進入多細胞期(圖1h)。

2.1.3 囊胚期

草金魚受精后3.50 h細胞進一步分裂，細胞堆積在動物極半球，胚盤高聳于卵黃上方，占卵體積的1/2，進入囊胚早期(圖1i)；受精后3.67 h，胚盤細胞繼續分裂，細胞向下方擴展，囊胚層較囊胚早期低，即為囊胚中期(圖1j)；受精后4.92 h，囊胚層沿卵表面向植物極擴展，開始產生下包作用，囊胚層變得扁平，即囊胚晚期(圖1k)。

2.1.4 原腸期

草金魚受精后7.73 h，進入原腸期。囊胚層細胞繼續下包卵黃1/3進入原腸早期(圖1l)；受精后8.92 h，囊胚層細胞下包卵黃1/2，進入原腸中期(圖1m)；受精后10.57 h，囊胚下包卵黃2/3，進入原腸晚期(圖1n)。

2.1.5 神經胚期

草金魚受精后10.80 h，囊胚細胞繼續下包卵黃至4/5，過程中細胞數量不斷增加，進入神經胚期(圖1o)；受精后12.02 h，胚孔閉合，卵黃被完全包裹，進入胚孔閉合期(圖1p)。

2.1.6 肌節出現及尾泡期

草金魚受精后14.20 h，胚孔封閉后軀干中段出現兩段肌節，即肌節出現期(圖1q)；受精后14.95 h，胚體尾部出現圓形亮點即尾泡，即入尾泡形成期(圖1r)。

2.1.7 器官形成期

草金魚受精后15.53 h，進入器官形成期，可看到腦的前段出現透明囊泡即眼囊，進入眼囊期(圖1s)；受精后17.50 h，在眼囊下方可觀察到暗色斑塊狀嗅囊，進入嗅囊出現期(圖1t)；受精后17.78 h，出現錐形尾芽，進入尾芽出現期(圖1u)；受精后19.17 h，出現透明的泡狀耳囊，進入耳囊形成期(圖1v)；受精后22.50 h，可觀察到多對肌節，肌體的中段出現不連續性的肌肉收縮，進入肌肉效應期(圖1w)；受精后28.67 h，心臟原基開始有節律的跳動，進入心跳期(圖1x)。

2.1.8 出膜期

受精后54.58 h，尾部清晰可見，可清晰看見頭部，進入出膜前期(圖1y)；受精后56.67 h，胚體扭動劇烈，開始破膜而出，完全破膜，進入出膜后期(圖1z)。

2.2 胚后發育

2.2.1 卵黃囊期仔魚

初孵仔魚：剛出膜的仔魚，附帶有卵黃囊，全長(4.48±0.30) mm，卵黃囊長(2.0±0.70) mm，卵黃囊膨大透明，緊貼魚體，卵黃囊約占全長的1/2，初孵仔魚靠卵黃囊中的營養物質生長，初孵仔魚背部及卵黃囊上均有黑色素細胞分布，眼部清晰可見。

圖1 草金魚胚胎發育分期a. 受精卵; b. 胚盤形成; c. 2細胞期; d. 4細胞期; e . 8細胞期; f. 16細胞期; g. 32細胞期; h. 多細胞期; i. 囊胚早期; j. 囊胚中期; k. 囊胚晚期; l. 原腸早期; m. 原腸中期; n. 原腸晚期; o. 神經胚期; p. 胚孔封閉期； q. 肌節出現期, →.示肌節; r. 尾泡形成期， →.示尾泡; s. 眼囊出現期, →.示眼囊; t. 嗅囊出現期, →. 示嗅囊; u. 尾芽出現期, →. 示尾芽; v.耳囊出現期, →.示耳囊; w. 肌肉效應期, →. 示肌節; x. 心跳期， →.示心臟; y. 出膜前期, →.示眼部; z. 出膜期, 上方→. 示色素；下方→. 示卵黃囊.

出膜后1 d：仔魚身體伸長，卵黃囊已縮小成前端膨大，后端細長的囊。背部及卵黃囊上黑色素細胞增多，尾柄處有鰭條出現(圖2a)。

出膜后2 d：卵黃囊明顯變小，頭部及至全身背側皮膚出現黃色素細胞。仔魚卵黃囊中出現空泡，有吞食跡象(圖2b)。

出膜后3 d：頭部及背部色素繼續沉積，心臟色素明顯沉積，卵黃囊繼續縮小成細棒狀，平衡能力及游泳能力增強(圖2c)。

出膜后4 d：卵黃囊基本吸收完畢，后端呈針狀，縮小明顯。腸道中開始出現異物顆粒，眼已能不斷轉動，下頜形成并可動(圖2d)。

出膜后5 d：仔魚的卵黃囊已耗盡，進入外源性

圖2 草金魚胚胎后期發育分期a. 出膜后1 d, a1.示卵黃囊上黑色素, a2.示卵黃囊; b. 出膜后2 d, b1.示黃色素; c.出膜后3 d; d. 出膜后4 d, d1.示眼部, d2.示黃色素e. 出膜后5 d, e1.示魚鰾; f. 出膜后6 d, f1.示背部圓點狀黃色素; g. 出膜后7 d, g1.示吻部, g2.示腸道內食物; h. 出膜后8 d; i. 出膜后9 d, i1.示峽部; j. 出膜后10 d, j1.示心臟; k. 出膜后12 d; l. 出膜后13 d; m. 出膜后15 d, m1.示鰾二室, m2.示尾鰭; n. 出膜后17 d, n1.示背鰭; o. 出膜后19 d; p. 出膜后21 d, p1.示鰓部; q. 出膜后25 d, q1.示背鰭, q2.示臀鰭; r. 出膜后34 d, r1.示鱗片; s. 出膜后36 d, s1.示鰓蓋, t. 出膜后38 d, t1.示胸鰭; u. 出膜后44 d.

營養階段，開始自由游動與攝食。黑色素沉積明顯，清晰可見，眼睛明顯。魚鰾中已充滿氣體，其輪廓清楚(圖2e)。

2.2.2 晚期仔魚

出膜后6 d：黑色素繼續沉積，頭部背面的黑色素細胞收縮成圓點狀而不成分枝狀(圖2f)。

出膜后7 d：消化道前端膨大，后端漸細，直通肛門，消化道中充滿食物，有排泄物排出，吻部有黑色素細胞出現(圖2g)。

出膜后8 d：魚體伸長，吻部黑色素細胞增多，體背黑色素細胞及黃色素細胞繼續沉積(圖2h)。

出膜后9 d：腸道為直形，有大量排泄物排出，鰓蓋膜可動，仔魚的下頜不斷運動(圖2i)。

出膜后10 d：鰓蓋膜已完全遮蓋了鰓，尾鰭基部形成了黑色素細胞和黃色素細胞的堆積(圖2j)。

出膜后12 d：頭部黑色素細胞及黃色素細胞繼續沉積，脊索末端彎向上方，尾鰭中形成了間質的堆積(圖2k)。

出膜后13 d：頭部收縮成圓點狀的黑色素細胞增多且增大，吻部黑色素細胞繼續堆積，尾鰭的間質開始形成了骨質鰭條(圖2l)。

出膜后15 d：仔魚鰾的中部有從中部內縊分為兩室的趨勢，鰾表面的黑色素細胞增多，進入鰾分二室期，可以清晰看見草金魚的尾鰭為深叉形(圖2m)。

出膜后17 d：體型增大，背鰭可見，消化道進一步增大，魚體呈半透明狀態，眼珠大而有光澤(圖2n)。

出膜后19 d：頭部及體背色素細胞進一步沉積，魚鰾二室明顯，消化道充滿體內多部分，吞食顆粒有明顯消化現象(圖2o)。

出膜后21 d：背鰭明顯，臀鰭可見，尾鰭繼續增大，色素沉積明顯，魚鰓清晰可見，游動迅速，鰓部血紅色明顯(圖2p)。

出膜后25 d：背鰭與臀鰭均清晰可見，尾鰭繼續變大變厚，體背及頭部黑色素細胞收縮成圓點狀并排列緊密，吻部有圓點狀黑色素出現，魚體半透明部位減少(圖2q)。

2.2.3 稚魚階段

出膜后34 d：背鰭與腹鰭進一步增大，開始有鱗片出現，半透明部位基本消失(圖2r)。

出膜后36 d：體色進一步變化，半透明部位已大部分消失，吻部明顯，游動敏捷(圖2s)。

出膜后38 d：稚魚已基本具有成魚外形，胸鰭清晰可見，此時魚體顏色大部分呈現灰色，鱗片進一步增長，尾鰭大而分叉，鰓蓋張合明顯(圖2t)。

出膜后44 d：大部分魚體體色轉變為紅色，身體透明特征消失，稚魚階段發育完成進入幼魚期，此時平均全長達(24.08±2.56) mm，其外部形態及生活習性均與成魚相似(圖2u)。

3 討 論

3.1 生活史的劃分

近年來，對于魚類的胚胎發育研究主要集中在一些經濟魚類及珍稀魚類中[8-9]，對于觀賞魚的胚胎及胚后發育研究較少。金魚是重要的觀賞魚種之一，養殖歷史可追溯到約1000年前[10]，其有著獨特的經濟價值及研究價值，例如金魚易得且一次能夠產下大量卵子，其胚胎較多的應用于發育生物學研究[11-13]，因此對草金魚的胚胎及胚后發育進行觀察研究有著重要的生物學意義。目前通常將魚類的早期生活史階段劃分為卵(胚胎)、仔魚及稚魚3個基本發育期[14]。在魚類早期生活史劃分的研究中，存在許多不同的觀點及不同的標準[15-17]，本研究采用“孵化”作為卵和仔魚期的劃分界限。

3.2 草金魚胚胎發育特點

與其他鯉科魚類一樣，草金魚受精卵的整個胚胎發育過程分為7個發育階段，包括卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期和器官形成期等，共歷時56.67 h。20世紀中期，李璞等[18]對金魚及鯽魚的胚胎發育分期進行了研究，發現它們之間基本上是相似的，可以代表典型的硬骨魚類發育過程。Tsai等[19]研究發現，普通金魚和斑馬魚(Daniorerio)這兩種硬骨魚類胚胎發育過程中整體形態特征十分相似，可將成熟的斑馬魚分子生物學技術用于金魚胚胎研究，可以進一步研究馴化與發育的進化關系。由于繁殖條件及種屬的不同，不同魚類胚胎發育所耗時間也不盡相同，其中在相同溫度下(23.0±1.0) ℃草金魚孵化時間略小于銀鯽(C.auratusgibelio)與普通鯽魚[20]，滇池高背鯽(C.auratus)受精卵在水溫 12.9～15.0 ℃下，歷時174.88 h孵化[21]，在斑鱖(Sinipercascherzeri)[22]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[23]等魚類中，溫度也會影響胚胎發育進程。

3.3 草金魚胚后發育特點

草金魚受精卵經56.67 h后孵化，初孵仔魚培育溫度為19～22 ℃，出膜后4 d卵黃囊基本消失，5 d卵黃囊耗盡。鯉科魚類馬口魚 (Opsariichthysbidens)在26～28 ℃水溫下，經108 h孵化后，卵黃囊消耗殆盡[24]；鯉科魚類唐魚(Tanichthysalbonubes)[25]在水溫23～29 ℃時，初孵仔魚5 d卵黃耗盡；鯉科魚類中華倒刺鲃[26]在水溫21.5～28 ℃條件下，6 d卵黃囊耗盡。卵黃囊期持續時間的長短受多因素影響，最主要的影響因素為溫度，溫度越高，卵黃囊消失越快，另外，營養(攝食)也是影響魚類生長的一個重要因素[27]。史先武等[28]研究發現，水溫保持在19～22 ℃時，長尾紅草金魚卵黃囊4 d基本消失；張國真等[29]研究發現，水溫約20 ℃時，草金魚卵黃囊3 d基本消失，本研究結果與前者的研究結果相同，而與后者研究的卵黃囊消失時間不同，這可能是由于本研究與前者的研究條件類似。草金魚孵化5 d后卵黃囊完全消失，進入外源性營養階段，開始攝食，這與唐魚[25]、齊口裂腹魚(Scizothoraxprenanti)[30]開始覓食的時間相同。許多魚類的仔魚在由內源性營養轉化到外源性營養的過渡階段常會出現大量死亡,其原因受多因素影響，但能否及時補充外源性營養是一重要影響因素[31]。

4 結 論

通過研究發現草金魚受精卵為黃綠色，呈卵圓形，在水溫(23.0±1.0) ℃下，歷時56.67 h完成整個胚胎發育過程。胚后發育可分為仔魚期、稚魚期和幼魚期。其中仔魚期又可分為卵黃囊仔魚期和后期仔魚，在水溫19～22 ℃的條件下，出膜后5 d，卵黃囊吸收完畢，卵黃囊仔魚期結束，進入后期仔魚階段。培育至34日齡，開始出現鱗片，標志后期仔魚發育完成，進入稚魚期，在44日齡時，鱗片生長完全，身體透明特征消失，稚魚階段發育完成，進入幼魚期。在胚胎及胚后發育過程中，溫度對其發育速度影響很大，因此在進行研究和繁殖實踐中要嚴格控制孵化和培育溫度。