魚類性別特異性DNA分子標(biāo)記研究進(jìn)展

施文瑞，王 磊，陳軍平，吳利敏，李學(xué)軍

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

魚類是目前分布最廣、種類最多的脊椎動物類群，已知的現(xiàn)存魚類約28 000余種[1]，超過了其他脊椎動物的總和，在脊椎動物的演化過程中處于承上啟下的關(guān)鍵地位。魚類具有豐富多樣的生物學(xué)特征和重要的經(jīng)濟(jì)價值，是人類獲取動物蛋白的主要途徑之一，對人類社會的生產(chǎn)生活具有重要意義。魚類的性別分化會受到外部環(huán)境因子(如溫度、光照和食物等)的影響[2]，如高溫會導(dǎo)致尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的遺傳雌性發(fā)育為生理雄性。魚類的生長和生殖關(guān)系密切[3]，因此了解魚類的性別決定機(jī)制對于研究其性別控制育種至關(guān)重要[4-5]，例如半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[6]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[8]等的雌性個體比雄性個體生長快，而黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[9]和羅非魚等的雄性個體比雌性個體生長快，因此通過調(diào)控此類魚的性別比例可以快速改變其生長性狀，在養(yǎng)殖中具有重要意義。

尋找性別特異分子標(biāo)記是一種較簡捷的進(jìn)行雌雄鑒定的方法。性別特異分子標(biāo)記是指魚類某種性別基因中特有的DNA片段，是一種通常只存在于異配性別中的特異DNA標(biāo)記。近些年來，科研人員用不同的分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、SSR、AFLP和SNP等在一些魚類中找到了有關(guān)性別特異或性別連鎖的DNA片段，為鑒定魚類的遺傳性別，定位和鑒定魚類性染色體奠定了基礎(chǔ)。篩選魚類性別相關(guān)分子標(biāo)記不僅能夠在生長發(fā)育早期鑒定魚類性別，而且可以鑒定偽雄魚和偽雌魚，這對培育具有生長優(yōu)勢性別的單性苗種以及魚類的性別控制均具有重要意義。

1 DNA分子標(biāo)記技術(shù)

目前對于分子標(biāo)記概念的界定有廣義和狹義兩種，廣義上的分子標(biāo)記是指能夠遺傳并且檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)，狹義的分子標(biāo)記(亦是本文中所提到的分子標(biāo)記)則僅指DNA標(biāo)記[10]。對比常規(guī)的遺傳學(xué)標(biāo)記(如形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記以及生化標(biāo)記)，DNA分子標(biāo)記具有其獨(dú)特的優(yōu)勢[11]：(1)DNA樣品的獲得不受外界環(huán)境及發(fā)育階段的影響；(2)標(biāo)記數(shù)量豐富且遍布整個基因組；(3)表現(xiàn)為中性，不會影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；(4)多態(tài)性高，自然存在的等位變異多；(5)試驗(yàn)所提取的DNA樣品在特定條件下能夠長期保存，對于試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證是非常有利的；(6)許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠區(qū)分純合體和雜合體。正是由于這些優(yōu)越的特性，DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用十分廣泛，分子標(biāo)記技術(shù)也在經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展后，日趨成熟。不同的分子標(biāo)記技術(shù)具有不同的特點(diǎn)，魚類性別研究中常用的分子標(biāo)記技術(shù)比較見表1。

表1 常用分子標(biāo)記技術(shù)的比較

2 魚類性別特異性DNA分子標(biāo)記研究進(jìn)展

2.1 魚類性別特異RAPD標(biāo)記

RAPD是由Williams等[12]于1990年利用隨機(jī)合成的單個引物進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)而尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標(biāo)記發(fā)展起來的一種技術(shù)，能夠快速、簡便地進(jìn)行遺傳標(biāo)記和遺傳多樣性分析，并廣泛應(yīng)用于魚類遺傳多樣性研究以及魚類種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域[13-15]。

楊玲等[16]以奧利亞羅非魚(O.aureus)為試驗(yàn)材料，獲得了1個雌性特異性的RAPD標(biāo)記片段(RAPD71699-1488)，并成功地將該RAPD標(biāo)記片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，在兩個群體共200尾個體上(雌、雄各100尾)驗(yàn)證的符合度為100%，可以應(yīng)用到奧利亞羅非魚的性別遺傳鑒定中；Luzio等[17]用ISSR和RAPD技術(shù)在斑馬魚(Daniorerio)的雌雄個體中測試了100個ISSR和280個RAPD引物，將得到的3個呈現(xiàn)性別特異的DNA片段進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后得到序列擴(kuò)增區(qū)，在斑馬魚群體中使用這些潛在標(biāo)記，可以在測試群體中正確識別80%的雄性(DrSM_M)和100%的雌性(DrSM_F1tDrSM_F2)；Sun等[18]在尼羅羅非魚(O.niloticus)中利用RAPD和AFLP技術(shù)找到4個性別連鎖標(biāo)記。利用RAPD技術(shù)在亞馬遜石脂鯉(Bryconamazonicus)[19]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[20]中也找到了性別特異DNA序列。

2.2 魚類性別特異AFLP標(biāo)記

AFLP即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，是1993年由Zabeau等[21]基于PCR技術(shù)發(fā)明創(chuàng)建的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛用于魚類遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析及標(biāo)記輔助育種等[22-24]。

劉昕[25]通過AFLP技術(shù)對比分析孔雀魚(Poeciliareticulata)雌雄基因組之間的不同，得到了1個雄性特異的AFLP標(biāo)記(PreF262)，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，建立了能夠快速鑒定孔雀魚遺傳性別的PCR技術(shù)；閆松松等[26]用AFLP技術(shù)篩選香魚(Plecoglossusaltivelis)的性別特異性分子標(biāo)記，僅引物組合E-ATG/M-CTG擴(kuò)增到1條雄性特異性條帶,以該雄性特異性AFLP條帶的DNA序列為模板，設(shè)計(jì)1對特異的PCR引物，并在10尾已知性別的香魚(雌雄各5尾)中擴(kuò)增檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，5尾雄魚均可擴(kuò)增到目的條帶，而5尾雌魚均無擴(kuò)增，表明該序列是雄性特異性分子標(biāo)記，可用于鑒別香魚的遺傳性別，并為香魚的性別決定機(jī)制和性別控制研究奠定基礎(chǔ)[26]；Vos等[27-28]利用AFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在太平洋藍(lán)鰭金槍魚(Thunnusorientalis)中存在雄性特征片段及其遺傳結(jié)構(gòu)的DNA序列；利用AFLP在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[29]和大顎小脂鯉(Salminusbrasiliensis)[30]中也找到了性別特異標(biāo)記。

2.3 魚類性別特異SSR標(biāo)記

SSR即簡單重復(fù)序列，由1～6個堿基的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，是一類信息量豐富、重復(fù)性好、多態(tài)性高、易操作、雜合度大的共顯性DNA分子遺傳標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于魚類遺傳多樣性研究、種群親緣關(guān)系研究等領(lǐng)域[31-32]。

在半滑舌鰨中分離出性別連鎖的SSR標(biāo)記CseF-SSR1，可用于區(qū)分ZW雌性和WW超雌性[33]；岳亮等[34]采用以BSA為基礎(chǔ)的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)雌、雄基因池中擴(kuò)增出8對差異條帶的引物，通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，引物 f383是與其雄性呈正相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記；Liao等[35]在半滑舌鰨中通過篩選基因組微衛(wèi)星鑒定了一個共顯性性別連鎖標(biāo)記(即CyseSLM)；Xu等[36]用微衛(wèi)星標(biāo)記在條石鯛(Oplegnathusfasciatus)中得到了一個Oplfa16的雄性特異性微衛(wèi)星標(biāo)記。此外，在五條(Seriolaquinqueradiata)[37]、多刺魚(Pungitiuspungitius)[38]、狹鱗庸鰈(Hippoglossusstenolepis)[39]等中均可分離出性別特異微衛(wèi)星標(biāo)記。

2.4 魚類性別特異SNP分子標(biāo)記

SNP作為一種新興的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景[40-42]。Houston等[43]用RR-seq、RNA-seq、RAD-seq技術(shù)得到了大西洋鮭(Salmosalar)>400 K的假定SNPs, 用于大西洋鮭的高密度SNP基因分型陣列, 該陣列可以清楚地區(qū)分養(yǎng)殖和野生種群內(nèi)部和之間不同來源的魚，陣列上包含的Y染色體特異性探針為性別鑒定提供準(zhǔn)確的分子遺傳學(xué)檢測；Palaiokostas等[45]用RAD-seq構(gòu)建了尼羅羅非魚的連鎖圖譜，并發(fā)現(xiàn)了一組與性別緊密相關(guān)的SNP標(biāo)記，并用RAD-seq技術(shù)構(gòu)建了第一個基于SNP的歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)連鎖圖譜，其由24個連鎖群上的6706個SNPs組成，與傳統(tǒng)的基于譜系的選擇相比，基于SNP的雌性歐洲鱸魚選擇效率顯示出輕微的優(yōu)勢，此項(xiàng)研究結(jié)果為歐洲鱸魚的多基因性別決定假說提供了額外的支持；王婷等[46]基于高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)SNP標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得了2個與雌、雄性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記；Bradley等[47]開發(fā)了精確的斑馬魚SNP遺傳圖譜，并將其應(yīng)用于性別決定的遺傳組分研究，結(jié)果表明，斑馬魚的性別決定是一個復(fù)雜的過程，除性染色體外，還在第5號和第16號染色體上鑒定了2個在性別決定方面具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因座。Xu等[48]在巖鯛(Oplegnathusfasciatus)中利用AFLP技術(shù)開發(fā)了3種雄性特異性SNP標(biāo)記，可用于該物種的遺傳性別的分子鑒定，為人工養(yǎng)殖鯛魚的進(jìn)步提供支撐。

2.5 基因組測序技術(shù)在魚類性別特異標(biāo)記中的研究進(jìn)展

Chen等[49]對雄性(ZZ)及雌性(ZW)半滑舌鰨的整個基因組進(jìn)行了測序，構(gòu)建了半滑舌鰨全基因組序列圖譜，這也是世界上第一個比目魚的基因組圖譜，從而為發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨的染色體起源、性別決定機(jī)制以及比目魚的底棲適應(yīng)機(jī)制提供了珍貴的基因資源；Fowler等[50]為了鑒定性別特異性基因型標(biāo)記，利用雙酶切RAD[51]技術(shù)對姊妹種肉色平鲉(Sebastescarnatus)和黃黑平鲉(S.chrysomelas)的基因組DNA進(jìn)行測序，在2個群體中均能檢測到雄性特異基因座，但未檢測到雌性特異基因座，這為其由XY決定性別機(jī)制提供了證據(jù)；Chen等[41]對黃顙魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)比較分析，篩選了至少21個性別決定和分化的相關(guān)基因；Wilson等[52]利用RAD標(biāo)簽群體基因組學(xué)在4個斑馬魚品系中發(fā)現(xiàn)了1個單一的性別連鎖區(qū)域；Maroso等[53]使用ⅡB型限制性內(nèi)切酶的RAD[54]技術(shù)對地中海8個地區(qū)的共140尾鲯鰍(Coryphaenahippurus)進(jìn)行研究，鑒定了大量SNP標(biāo)記，確定了311個性別相關(guān)位點(diǎn)。

3 展 望

我國魚類分布廣泛，種質(zhì)資源豐富，許多魚類雌雄個體之間存在著明顯的生物學(xué)差異，如個體大小、性成熟年齡和體型等，根據(jù)雌、雄魚經(jīng)濟(jì)性狀的差異來調(diào)控其性別比例可大幅提高相關(guān)魚類的經(jīng)濟(jì)效益，因此開展這些魚類性別相關(guān)分子標(biāo)記的研究具有重要意義。截至目前，雖然魚類性別相關(guān)分子標(biāo)記的研究取得了一定的進(jìn)展，但是仍存在一些問題。由于魚類是最低等的脊椎動物，有些性別相關(guān)分子標(biāo)記在同一物種不同群體之間甚至家系之間也可能存在一些差異；另外，魚類種類較多，進(jìn)化程度相差較大，有些魚類沒有進(jìn)化出異質(zhì)性染色體，根據(jù)其形狀和大小很難區(qū)分其性染色體和常染色體，可利用熒光原位雜交技術(shù)對已發(fā)現(xiàn)的性別連鎖的基因或標(biāo)記定位，可以鑒定性染色體，從而能夠?qū)崿F(xiàn)魚類早期的性別鑒定。高建軍等[55]發(fā)現(xiàn)能夠成功尋找到性別特異標(biāo)記的魚類通常是存在性染色體的魚類，使用傳統(tǒng)方法較難篩選出性別相關(guān)分子標(biāo)記。在下一代測序時代，越來越多的物種以前所未有的速度積累了序列資源，RAD-seq是在高通量測序技術(shù)的基礎(chǔ)上興起的一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡化基因組測序技術(shù)，具有覆蓋整個基因組的特點(diǎn)，可以更容易和更經(jīng)濟(jì)地開發(fā)基因組標(biāo)記[51-54]及性別研究，通過RAD-seq及其衍生技術(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，結(jié)合QTL定位闡明其性別決定機(jī)制并開發(fā)性別標(biāo)記，已成為研究魚類性別及其性別特異標(biāo)記的一個重要手段。近年來，隨著測序成本的下降，簡化基因組測序技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于魚類性別相關(guān)標(biāo)記的篩選，相信隨著測序成本的進(jìn)一步下降，基因組測序技術(shù)將全面應(yīng)用于魚類性別相關(guān)標(biāo)記篩選及性別調(diào)控機(jī)理研究。