大黃與抗生素體外協同抗哈維氏弧菌研究

郭偉良, 陳永貴, 鄧恒為,3, 鐘志鴻, 王 菲, 王世鋒, 孫 云, 陳雪芬, 周永燦

( 1.海南大學，南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228； 2.海南大學 海洋學院，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南 海口 570228； 3.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275 )

隨著水產養殖規模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高，養殖環境惡化也日趨嚴重，病害發生越來越頻繁，嚴重制約水產業的發展[1-3]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是海水環境中常見的條件致病菌，其致病性受宿主的生理狀態及水質環境條件等多方面因素影響[4-5]。近年來哈維氏弧菌已成為海水養殖動物的主要的病原菌之一，對海洋漁業生產造成嚴重的經濟損失。

抗生素由于具有起效快、效果好、促生長等優點，在水產動物病害防控中得到大量的使用[6]，然而由于抗生素在使用過程中缺乏科學性指導，抗生素的使用受到極大的限制，為此人們不得不尋找水產養殖動物病害防控的綠色有效途徑[7-8]。目前，免疫制劑和中草藥防治最受推崇。免疫制劑效果較好，但其專一性較強，常常只是針對某種病原菌體，且會對變異后的病菌失效[9]。中草藥不僅毒副作用小、還具有增加食欲、提供營養、促進生長、增強免疫力、提高抗病力和抗應激力等多重功效，具有很好的開發前景。然而中草藥一般起效慢，作用力溫和，對于突然爆發的流行性疾病的控制力弱[10-11]。近年來，中草藥聯合低劑量抗生素，共同應用于水產養殖動物病害，起到很好的效果，被認為是最有前途的水產動物病害防控手段之一[12]。為了更好地將中草藥協同抗生素應用于水產動物病害防控中，對中草藥與抗生素之間相互作用的研究是非常必要且迫切的。

化學計量學是化學分析的常用方法，已被廣泛應用于石油化工、農業、林業和醫藥工業等領域。其中響應面法常用于工藝條件優化[13-14]。響應面法的最大優點是，在合理的試驗設計下，能以最少的試驗點數，獲取最大限度的試驗信息，其采用多元二次回歸的方法作為函數估計的工具，研究各因素及其交互作用對工藝過程考察指標(響應值)的影響，精確的表述各因素和考察指標之間的關系。筆者在篩出體外抗哈維氏弧菌活性較好的中草藥基礎上，采用全組合方法初步篩選與中草藥具有協同抗菌作用的抗生素，然后采用中心組合設計試驗結合響應面法，分析中草藥與抗生素之間對哈維氏弧菌抑制活性的影響，精確的表述中草藥提取液含量、抗生素含量與抗哈維氏弧菌活性之間的關系，以確定其最佳配比，為中草藥協同抗生素在水產動物病害防控中的應用提供試驗依據，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秦皮、黃連、大黃、五倍子、艾葉、金銀花、蒲公英(海南源安隆藥品超市)；強力霉素、金霉素和土霉素(寧波瑞源生物科技有限公司)，鏈霉素和新霉素(北京拜爾迪生物技術公司)，四環素(Sigma公司)；哈維氏弧菌為本實驗室分離鑒定和保存。

液體培養基：酵母粉1 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉30 g/L、牛肉膏3 g/L；用1 mol/L的氫氧化鈉和鹽酸將pH調至7.5。半固體培養基(上層培養基)：液體培養基中加入1%的瓊脂粉制備而成。固體培養基(下層培養基)：液體培養基中加入2%的瓊脂粉制備而成。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥水提液樣品的制備

7種中草藥于80 ℃烘箱中干燥2 h，用研缽研碎，過40目篩，制成粉末樣品。分別精密稱取5.0 g的7種中草藥粉末樣品，裝入250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL水，浸潤30 min，置于沸水浴中，提取2 h，8000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，制成生藥質量濃度為100 mg/mL中草藥水提液樣品。

1.2.2 瓊脂擴散法檢測藥物體外抗哈維氏弧菌活性[15]

將凍存管中哈維氏弧菌30 ℃水浴解凍、轉移到液體培養基中，30 ℃ 150 r/min培養24 h，按1‰接種量接入新液體培養基中，30 ℃ 150 r/min培養16 h，按該條件再傳一代，4000 r/min離心收集菌體，用無菌生理鹽水重懸菌體并稀釋使其600 nm處吸光度值為0.8(活菌密度約為2.82×108cfu/mL)。濕熱滅菌后的固體培養基趁熱倒入培養皿中，每個培養皿為15 mL，平放靜置冷凝。按2%(體積比)接種量將制備的菌懸液接入低于50 ℃而未冷凝的半固體培養基中，然后將半固體培養基倒入冷凝的裝有固體培養基的平皿中，每個平板10 mL，搖勻平放靜置冷凝。用內徑為5 mm打孔器在雙層培養基上均勻打3個孔，在每個孔中加60 μL樣品，30 ℃培養16 h，采用游標卡尺量抑菌圈直徑，每個樣品平行測3次，取平均抑菌圈直徑作為該樣品的抑菌圈直徑。

標準曲線繪制：篩出的生藥質量濃度為100 mg/mL中草藥水提液作為母液，將母液和6種抗生素按設計質量濃度配制成6個等質量濃度梯度標準溶液，質量濃度梯度范圍見表1。采用瓊脂擴散法測定每個標準溶液的抑菌圈直徑，以質量濃度對數為橫坐標，抑菌圈直徑為縱坐標，繪制標準曲線。

篩選出具有體外抗哈維氏弧菌活性的中草藥水提液樣品。

1.2.3 全組合方法篩選與中草藥水提液協同抗哈維氏弧菌的抗生素

篩出的中草藥提取液，分別以一定質量濃度與抗生素進行一一復合。假設兩個藥物間不存在交互作用，則根據兩者的標準曲線估算兩者復合物的抑菌圈直徑，具體估算方法如下：a和b藥物標準曲線分別為①y=a1lg(C)+b1和②y=a2lg(C)+b2，而a和b藥物在復合物中的質量濃度分別為C1和C2，則復合前它們的抑菌直徑分別為y1和y2，即③y1=a1lg(C1)+b1和④y2=a2lg(C2)+b2，而a藥物形成直徑為y2的抑菌圈時其質量濃度為C3，⑤C3=10[(y2-b1)/a1]；b藥物形成直徑為y1的抑菌圈時質量濃度為C4，⑥C4=10[(y1-b2)/a2]，則復合物形成的抑菌圈直徑應介于⑦y3=a1lg(C1+C3)+b1和⑧y4=a2lg(C1+C4)+b2之間。采用瓊脂擴散法測定復合物體外抗哈維氏弧菌活性。如果測定的抑菌圈直徑小于y3和y4，則a和b藥物間存在拮抗效應；如果大于y3和y4，a和b藥物間存在協同抗菌作用。

1.2.4 中心組合設計試驗結合響應面法中草藥提取液與抗生素復合比

以篩出的中草藥水提液及其具有協同抗菌作用抗生素的含量作為考察因素，進行中心組合設計試驗，然后以抑菌圈直徑作為響應值，進行響應面分析，分析各因素對響應值的影響和各因素之間的交互作用，以尋找各因素之間的最佳復合比例。

2 結果與分析

2.1 抗哈維氏弧菌中草藥篩選結果

瓊脂擴散法分別測定生藥質量濃度為100 mg/mL的7種中草藥水提液體外抗哈維氏弧菌活性，結果顯示，大黃、金銀花和黃連的水提液具有明顯的抑菌圈，其直徑分別為(10.06±0.08)、(7.05±0.08) mm和(7.00±0.06) mm，選擇體外抑菌活性最好的大黃水提液進行下一步試驗。

2.2 標準曲線的繪制

大黃水提液、四環素、土霉素、強力霉素、新霉素、金霉素和鏈霉素的標準曲線及其參數見表1，各藥物標準曲線的相關系數均高于0.9274，表明各藥物質量濃度對數與其抑菌圈直徑間呈較好的線性關系，可用于各藥物在特定質量濃度下抑菌圈直徑的預測。

2.3 全組合試驗考察中草藥與抗生素之間的交互作用

采用全組合試驗設計方法考察大黃水提液與6種抗生素之間的交互作用，其復合方案、復合物的抑菌圈直徑估算值范圍和實際檢測值見表2，大黃水提液與四環素、土霉素和強力霉素之間有著較強的協同抗菌作用，尤其與土霉素之間的交互作用非常顯著，促進效率達到了57.42%。而這3種抗生素均同屬于四環素類抗生素。大黃水提液與新霉素、金霉素和鏈霉素之間無顯著交互作用。

表1 各藥物的標準曲線方程及其參數

表2 全組合試驗方案及其試驗結果

2.4 中心組合設計試驗結合響應面法考察中草藥與抗生素復合后的交互作用

以大黃水提液、四環素、土霉素和強力霉素質量濃度為考察因素，進行四因素三水平的中心組合設計試驗，其因素水平見表3，其設計方案與試驗結果見表4。

以抑菌圈直徑作為響應值(y)，各藥物的質量濃度編碼值作為變量，采用SAS RSREG程序對試驗結果進行響應面分析試驗，回歸模型為y=15.2157+0.4258x1+0.1105x2+0.2268x3+0.4728x4-0.5484x12+0.1018x1x2-0.0080x1x3-0.1183x1x4-0.0044x22+0.2378x2x3+0.4055x2x4+0.0786x32-0.4533x3x4-0.2289x42

模型的相關系數為0.8239，說明響應值82.39%信息量是由所選變量引起的，采用F檢驗方法對模型進行顯著性檢驗，其Pr>F值為0.0104，表明模型顯著可靠。采用F檢驗方法對模型中各項系數進行顯著性檢驗，結果見表5，在設計的質量濃度范圍內，大黃水提液(x1)、土霉素(x3)和強力霉素(x4)的質量濃度對抑菌圈直徑(y)影響顯著，大黃水提液和強力霉素的質量濃度影響為極顯著，而四環素(x2)在設計的低質量濃度范圍內對抑菌圈直徑(y)的影響并不顯著。Pr>F(x1x2)、Pr>F(x1x3)、和Pr>F(x1x4)均大于0.1，表明低質量濃度的3種抗生素對大黃水提液的抑菌活性的促進作用并不顯著，而x2x3和x2x4的系數為正，表明四環素對土霉素和強力霉素有一定促進作用，但x3x4系數為負，且Pr>F(x1x4)<0.05，表明土霉素與強力霉素之間呈顯著交互抑制作用。

表3 大黃水提液與抗生素復合中心組合設計試驗因素水平表

表4 中心組合設計試驗方案及試驗結果

表5 響應面分析結果

兩兩藥物之間交互作用的響應曲面圖見圖1～圖6，可以直觀的觀察到兩兩藥物之間對響應值的影響，由圖1可知，抑菌圈直徑(y)沿著大黃水提液(x1)的坐標軸由低質量濃度至高質量濃度變化呈拋物線狀，先增后降，而響應曲面與四環素(x2)坐標軸呈平行態，故在設計的質量濃度范圍內，四環素的質量濃度對y基本無影響，而其等高線圖呈半橢圓形，其軸線與坐標軸呈幾乎平行態，故大黃水提液與四環素在考察的質量濃度范圍內交互作用不顯著；由圖2可知，抑菌圈直徑(y)沿著大黃水提液(x1)的坐標軸變化趨勢與圖1基本一致，而沿著土霉素(x3)坐標軸，隨著土霉素質量濃度增加，抑菌圈直徑(y)也在不斷增加，而等高線與圖1類似，故大黃水提液與土霉素在考察的質量濃度范圍內交互作用也不顯著；圖3響應曲面所呈規律與圖2相類似，大黃水提液與強力霉素在考察的質量濃度范圍內交互作用也不顯著；圖4與圖5的響應曲面都是沿著(-1，-1)至(1，1)直線劇增，至高區域在(1，1)附近，其等高線也呈半橢圓形，其軸線與(-1，-1)至(1，1)直線幾乎平行，四環素(x2)與土霉素(x3)、強力霉素(x4)之間存在著交互促進作用；相反，圖6響應曲面都是沿著(-1，-1)至(1，1)直線劇降，至低區域在(1，1)附近，其等高線也呈半橢圓形，其軸線與(-1，-1)至(1，1)直線幾乎平行，土霉素(x3)與強力霉素(x4)之間存在著顯著的交互抑制作用。

通過以上分析，表明各藥物之間的關系較為復雜，采用模式搜索方法對響應模型最優化配方進行搜索，結果顯示，在模型可預測范圍內，大黃水提液與四環素、土霉素和強力霉素的最佳配比為45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳復合方案下，模型預測其抑菌圈直徑(y)為16.07 mm。

圖1 y=f(x1, x2)的響應面和等高線

圖2 y=f(x1, x3)的響應面和等高線

圖3 y=f(x1, x4)的響應面和等高線

圖4 y=f(x2, x3)的響應面和等高線

圖5 y=f(x2, x4)的響應面和等高線

圖6 y=f(x3, x4)的響應面和等高線

2.5 驗證試驗

采用響應面法對大黃與抗生素的復合方案進行優化結果，大黃水提液∶四環素∶土霉素∶強力霉素=45∶0.07∶0.12∶0.10，在此最佳復合方案下，模型預測其抑菌圈直徑(y)為16.07 mm，在最佳的復合方案下進行平行3次驗證試驗，抑菌圈直徑(y)為(15.90±0.09) mm，與預測值間相對誤差為1.06%，表明該方法確實可行。

3 討 論

文獻報道[16-20]，大黃提取液有顯著的體外抗哈維氏弧菌活性，其最小抑菌質量濃度為0.24～50 mg/mL，本試驗采用瓊脂擴散法檢測7種中草藥水提液體外抗哈維氏弧菌活性，試驗結果顯示，同為100 mg/mL質量濃度下大黃水提液抗哈維氏弧菌抑菌圈最大[(10.06±0.08) mm]，其最小抑菌質量濃度低于25 mg/mL(大黃水提液標準曲線最低質量濃度)，與上述的文獻報道基本相符。中草藥與抗生素聯合應用，是解決中草藥起效慢和對重癥或急癥療效不顯著、抗生素耐藥機率高和藥物殘留等難題的有效途徑之一，然而并非所有中草藥和抗生素間均存在協同作用，甚至很多情況下兩者之間存在明顯的拮抗作用，為此中草藥與抗生素配伍使用必須先考察兩者間的交互作用[21]。目前常采用的方法有棋盤法、時間—殺菌曲線方法和瓊脂擴散法，然而棋盤法因采用微孔板作為病原菌培養容器，培養容量小，病原菌生長受外界因素干擾大，結果準確度難以得到保障，而且僅限于考察兩兩藥物之間的交互作用[22-23]；而時間—殺菌曲線較為費時費力[24-25]。為此本研究采用操作簡便、結果可靠的瓊脂擴散法考察兩兩藥物之間的交互作用[26]，結果顯示，在較高質量濃度下四環素類抗生素土霉素(0.27 mg/mL)、強力霉素(0.20 mg/mL)和四環素(0.13 mg/mL)分別對大黃水提液(生藥質量濃度67 mg/mL)的體外抗哈維氏弧菌活性具有促進作用，而氨基糖苷類抗生素鏈霉素和新霉素對大黃水提液的抗哈維氏弧菌體外抑制活性沒有顯著的促進作用，張玉國[27]研究表明，25～100 mg/mL大黃水提液可使大腸桿菌(Escherichiacoli)的四環素最小抑菌質量濃度降低1～3個梯度，本試驗研究結果與該結果基本吻合。采用中心組合設計試驗結合響應面法考察大黃水提液、土霉素、強力霉素和四環素組合后兩兩藥物之間的抗菌交互作用。姚遠等[28]成功采用響應面法考察了乳酸鈉、茶多酚與殼聚糖對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抑制作用間的交互作用，發現三者對銅綠假單胞菌的抑菌效果由大到小為乳酸鈉、殼聚糖、茶多酚；乳酸鈉和茶多酚存在明顯的拮抗作用；乳酸鈉和殼聚糖存在明顯的協同作用；而茶多酚和殼聚糖之間交互作用不顯著，并獲得乳酸鈉和殼聚糖最佳復合配比為62.5∶3.17。而本研究結果顯示土霉素(0.06～0.27 mg/mL)、四環素(0.01～0.07 mg/mL)和強力霉素(0.05～0.11 mg/mL)在低質量濃度情況下對大黃水提液(10～50 mg/mL)的抗哈維氏弧菌的體外抑制活性無顯著的促進作用，這與報道的大黃提取液(2 mg/mL)與四環素(5 μg/mL)對弧菌發光抑制作用為加和作用結果[29]相符；響應面法分析表明，土霉素與強力霉素體外抗哈維氏弧菌活性時存在著顯著的交互抑制作用。經過中心組合設計試驗，結合響應面法優化，獲得大黃、四環素、土霉素和強力霉素的最佳復合比，并根據模型給出預測值，在最佳復合方案下進行了驗證試驗，得出該方法確實可行的結論，在中草藥和抗生素聯合用藥研究方面提供新的思路和方法，具有廣闊的應用前景。

大黃主要抑菌成分為蒽醌類化合物，其抗菌機制主要包括通過抑制病原菌細胞線粒體呼吸電子傳遞；抑制菌體糖及糖代謝中間產物的氧化和脫氫過程，影響組織細胞生命活動所需能源的供應；與DNA結合，干擾其模板功能，抑制蛋白質和核酸合成；降低生物膜的穩定性，干擾能量代謝的酶促反應等[20]。四環素類抗生素通過與細菌胞內核糖體30S亞基形成可逆結合體，抑制蛋白質合成；也可通過結合線粒體70S亞基，抑制線粒體蛋白質的合成[30]。大黃與四環素作用機制和靶位不同，這可能是兩者之間存在協同抗哈維氏弧菌的原因，然而兩者的協同抗菌機制仍需進一步研究確定。雖然本研究結果表明，大黃水提液與四環素體外具有協同抗哈維氏弧菌作用，但兩者聯合應用于防治哈維氏弧菌引發的動物疾病還需結合藥物動力學與藥效學等多因素進行研究。