重癥手足口病患兒血清Th17、Treg動態變化及預后評估價值

孫濤 杜鳳梅

摘要 目的：動態監測腸道病毒71型（EV71）陽性重癥手足口病患兒外周血Th17、CD4⁺CD25⁺Treg表達變化及其意義。方法;收治重癥手足口病患兒60例作為重癥組，同期選擇普通組105例，健康對照組30例。監測各組CD4⁺CD25⁺Treg、Th17及細胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的表達。結果：重癥組Th17、IL-6、IL-10、IL-17的表達明顯高于健康對照組（P<0.01），而CD4⁺CD25⁺Treg、TGF-β的表達明顯低于健康對照組（P<0.01）。結論：重癥組手足口病患兒中Th17表達升高、CD4⁺CD25⁺Treg表達降低，且與病情嚴重程度相關，可作為預測病情嚴重程度及預后評估的重要參考指標。

關鍵詞 手足口病;Th17;CD4⁺ CD25⁺ Treg;預后評枯

手足口病的病原主要是腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇A組16型，近幾年來EV71感染的病例在我國各地皇上升趨勢。重癥手足口病以EV71感染多見，病情兇險，并發癥多，病死率高[1，2]。因此早期發現并及時治療重癥患兒，可提高搶救成功率，挽救患兒生命。

資料與方法

分層隨機抽樣2016年3月-2016年9月入住我院感染科的手足口病患兒165例，均符合衛生部《手足口病診療指南2010版》診斷標準[3]。其中男95例，女70例，年齡10個月～5歲，平均2.2歲。同期選擇普通組105例，健康對照組30例。

方法：入組患兒分別于病程第1、5、10天采集EDTA靜脈抗凝血各3mL，分別進行檢測。①Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg細胞的檢測：對于Th17細胞標記的處理，首先分離外周血單個核細胞（PBMC），用抗凝管采集外周靜脈血2mL，加入2mL的淋巴細胞分離液，1000×g離心5min，離心后管內容物分為4層，從上往下依次為血漿層、白膜層、淋巴細胞分離液層、紅細胞層。用毛細吸管吸出白膜層中的單個核細胞置于清潔離心管內，加入4～5mL PBS洗滌2次，棄上清即得所需細胞。加入CD3-APC、CD8-PE-Cy7流式抗體各5μL，混勻，4℃避光孵育30min。加入1mL PBS洗滌2次，447×g離心5min棄上清。加入100μL破膜/洗滌緩沖液（蒸餾水1：10比例稀釋原液）進行細胞打孔利于細胞因子染色，室溫避光5min，加入1mL PBS洗滌，447×g離心5min棄上清，此步驟重復1次，加入100μL破膜/洗滌緩沖液并立即加入5μL PE標記的鼠抗人IL-17抗體，室溫避光20min，加1mL PBS靜置30min，期間每隔10min在斡旋震蕩儀上混勻1次，使抗體與細胞內受體充分結合，447×g離心5min棄上清，重懸細胞于300～400μL PBS中，充分混勻后上流式細胞儀進行檢測。②血清細胞因子檢測：采用雙抗體夾心ELISA法檢測患兒血清TCF-β、IL-6、IL-10和IL-17的含量，檢測試劑盒購自青島騰輝醫學科技有限公司，按說明書進行操作。

統計學處理：使用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料采用（x±s）表示，采用方差分析，各組不同時間點間計量資料的比較采用重復測量的方差分析，同一時期各組與健康對照組比較采用Dunnett-t檢驗，各組內不同時間點的兩兩比較采用配對t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

各組外周血TGF-β、IL-6、IL-10和IL-17的表達比較：病程第1天普通組、重癥組中TGF-β的表達均低于健康對照組，且隨病情的加重呈下降趨勢。IL-6、IL-10和IL-17的表達均高于健康對照組，且隨病情的加重呈上升趨勢。上述各血清細胞因子組間比較差異均有統計學意義。

各組患者Th17、CD4⁺ CD25⁺Treg細胞表達的動態觀察結果比較：病程第1d普通組、重癥組Th17的表達均高于健康對照組，隨病情的加重呈上升趨勢。普通組、重癥組CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達均低于健康對照組，隨病情的加重呈下降趨勢。各組間免疫指標比較差異均有統計學意義。

重癥組存活與死亡患兒Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg細胞表達的動態觀察結果比較：對各組Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達進行動態觀察發現，在觀察期間存活組Th17的表達水平明顯低于死亡組，差異有統計學意義（P<0.05），CD4⁺CD25⁺Treg的表達在病程第1天差異無統計學意義（P>0.05），隨著病情的進展，第5、10天差異有統計學意義（P<0.05）。

重癥組存活與死亡患者Th17、CD4⁺CD25⁺ Treg細胞表達測定：其中Th17細胞標記為CD3⁺ CD8^-IL-17⁺，從淋巴細胞中選取T細胞，以CD3⁺ CD8^-確定CD4⁺ T細胞。

討論

手足口病是由多種腸道病毒引起的兒童常見傳染病，人群對其普遍易感，且感染后臨床表現輕重不一，輕者僅表現為自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，重者可出現腦干腦炎、神經源性肺水腫或肺出血，甚至心肺衰竭[4，5]。

本研究發現手足口病組隨病情進展Th17的表達水平逐步增高，IL-17有著相同的表達趨勢，CD4⁺ CD25⁺ Treg表達水平逐步下降。CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞/Th17細胞平衡失調的機制不明確。EV71感染導致CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞/Th17細胞平衡失調，考慮可能為EV71感染患兒隨著病情的加重外周血淋巴細胞絕對數下降，CD4⁺ T細胞也隨之下降，CD4⁺CD25⁺ Treg比例的降低可能與其有關。

綜上所述，手足口病患兒體內存在免疫功能紊亂，CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞/Th17細胞表達的失衡能反應手足口病，尤其是重癥患兒機體免疫抑制狀況。重癥手足口病患兒Th17，CD4⁺ CD25⁺ Treg的表達水平可作為預測病情嚴重程度及評估預后的一項敏感而有效的指標，為臨床治療中適時給予免疫調節治療提供理論依據。Th17、CD4⁺ CD25⁺ Treg檢測具有簡單、快捷、準確等特點，值得臨床推廣。

參考文獻

[1]唐紅平，汪秋珍，李德輝，等.重癥手足口病42例臨床分析[J].新醫學，2008，39（2）：718-720.

[2]田健美，李健琴，孔小行，等.144例手足口病患兒細胞和體液免疫變化及意義[J].臨床兒科雜志，2011，29（2）：1156-1158.

[3]手足口病診療指南2010年版[S].衛生部，2010.

[4]李雙杰.腸道病毒71型感染性疾病[J].實用兒科臨床雜志，2008，23（2）：1780-1782.

[5]朱汝南，錢淵，鄧潔，等.北京市兒童手足口病與腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型感染有關[J].中華流行病學雜志，2007，28（3）：1004-1008.