視網膜激光光凝術對貝伐單抗在兔眼內藥代動力學的影響＊

陳姣 ，鄧蕓 ，趙雁之 ，元芳秀 ，劉維鋒

(1、南昌大學第三附屬醫院眼科醫院，南昌 330006；2、江西省婦幼保健院兒保科，南昌 330006)

糖尿病黃斑水腫（DME）是引起糖尿病患者視功能下降的主要病因。有研究表明，接受了視網膜激光光凝治療的DME患者中，有超過15%患者仍出現進行性視力下降[1-3]。通常對該類患者進行玻璃體腔內抗血管內皮生長因子藥物注射治療，從而降低其視網膜血管的通透性，有效減輕彌漫性黃斑水腫[4，5]。然而臨床工作中發現，接受過視網膜激光光凝治療的DME患者進行玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子后對于黃斑水腫的緩解作用，顯著弱于未接受過視網膜激光光凝治療的DME患者[6]。由于貝伐單抗直接作用于眼部，其藥效的發揮與藥物在眼內的濃度直接相關。由此，我們推測視網膜激光光凝治療可能影響抗血管內皮生長因子藥物在眼內的處置及濃度，從而影響藥效。為了證實這種推測，本研究將采用兔全視網膜激光光凝模型，通過在該模型下貝伐單抗的注射、樣本采集、濃度測定、藥代動力學參數計算及統計學分析，以探討全視網膜激光光凝對眼內貝伐單抗濃度和暴露量的影響，為臨床全視網膜激光光凝后玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子藥物的劑量調整提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 兔全視網膜激光光凝模型 選取灰兔18只（36 只眼），1.5kg-2.0kg，雌雄不限，由南昌大學動物實驗室提供。肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉兔，左眼用復方托吡咔胺眼液散瞳后，應用間接眼底鏡532nm激光進行全視網膜光凝，光斑為Ⅲ級光斑，功率為90-120mw，時間為0.1s，平均激光點數960±130；1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 組別激光點數分別為 1090±81、984±189、938±124、1019±34、893±62、838±143，各時間段比較差異無統計學意義(F=1.75，P=0.19)。

1.2 玻璃體腔注射 視網膜激光光凝后2周雙眼進行玻璃體腔注射。用1ml的注射器取0.05ml貝伐單抗，于兔眼上方角膜緣后2.5mm穿刺進入玻璃體腔，將藥液注射入玻璃體腔內，拔出針頭后局部用棉簽壓迫。術后左氧氟沙星滴眼液點眼。

1.3 樣本制作 貝伐單抗玻璃體腔注射后，分別于1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 空氣栓塞處死 3 只兔子獲取6眼，取出眼球用生理鹽水沖洗，固定眼球，獲取玻璃體、視網膜脈絡膜樣本，直接保存于-80°的冰箱，直至樣本分析之前。

1.4 酶聯免疫吸附實驗 （ELISA實驗）做出貝伐單抗的標準曲線；將Recombinant Human VEGF165（1.0μg/ml 100μl）(R&D Systems，lnc)包被于酶標板中，以備測定時使用；提前將樣本玻璃體、視網膜脈絡膜碾磨加工并稀釋好；酶標板各反應孔中加入稀釋樣品100μl，洗滌3次；酶標板各反應孔中加入辣根酶標記山羊抗人IgG(中山金橋ZSGB．BIO)，2h后洗滌3次；酶標板各反應孔中加入顯色液A和顯色液B顯色并終止反應；最后應用酶標儀（Rayto RT-6100酶標分析儀）讀取玻璃體、視網膜脈絡膜樣本中吸光度值，計算得出貝伐單抗的濃度。

1.5 統計學方法 采用單因素方差分析t檢驗對玻璃體、視網膜脈絡膜中不同時間段的貝伐單抗濃度進行統計學分析，并計算藥物曲線下面積（AUC）。

2 結果

2.1 玻璃體中貝伐單抗的平均藥物濃度在對照組和激光組 各時間點兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。 詳見表 1。

2.2 在各組織不同時間點縱向比較中，均呈下降趨勢，但在激光組和對照組玻璃體中的濃度下降有統計學意義（F=5.25、15.79，P＜0.01）；而激光組和對照組視網膜脈絡膜藥物濃度下降差異無統計學意義（F=0.03、0.65，F=0.99、0.66），表明藥物在玻璃體中的清除速率顯著高于視網膜脈絡膜中。

2.3 通過計算藥物曲線下面積（AUC），發現藥物注射30d內，貝伐單抗在對照組兔眼玻璃體中的暴露量 AUC30d 為 919.825μg/ml·d，顯著高于激光組兔眼玻璃體中的暴露量（732.285μg/ml·d），差異有統計學意義（P=0.04）。激光組和對照組兔眼視網膜脈絡膜中的貝伐單抗暴露量AUC30d分別是729.115μg/ml·d、724.505μg/ml·d， 經比較差異無統計學（P=0.58）。 見圖 1。

表1 激光組和對照組眼內組織貝伐單抗濃度對比（μg/ml）

圖1 不同組織激光組和對照組貝伐單抗暴露量比較

3 討論

抗血管內皮生長因子藥物廣泛應用于眼科臨床，在不同的眼科疾病中發揮不同的作用。目前，在不同的眼部環境中藥物代謝動力學是否會發生改變尚未明確。有學者對玻璃體切割術后玻璃體腔中血管內皮生長因子清除率、雷珠單抗代謝清除率進行考察，發現其清除率均加快[7-9]；Chin[10]和Yang[11]進行全視網膜激光光凝（PRP）與玻璃體腔注射貝伐單抗的治療，臨床效果明顯；而Pikkel[12]通過研究發現聯合治療與PRP或者抗血管內皮生長因子注射單獨治療并未見明顯改善。因此，PRP是否會影響抗血管內皮生長因子藥物在眼中的濃度和處置進而影響其藥效，尚不明確。本研究以兔眼為模型，旨在研究PRP是否對貝伐單抗在兔眼中的處置和暴露量產生影響。

本研究結果表明，在抗血管內皮生長因子注射后第2d玻璃體貝伐單抗藥物濃度在對照組的含量比激光組高，差異有統計學意義，其他時間點差異無統計學意義，表明視網膜激光可能在一定程度上加快藥物清除；這和臨床中激光組的療效降低相一致，揭示了臨床療效差異的潛在原因。提示臨床治療中，對于激光治療的患者，需要加大貝伐單抗的劑量。

多數學者研究認為兔眼單抗的藥物半衰期為6d 左右[13，14]，且有效濃度能維持 3 個月[14]，這和本研究中貝伐單抗在30d內的濃度分布相一致。在本研究中，貝伐單抗在兔眼注射后，快速達到峰值，然后以較高濃度維持在兔眼中，消除緩慢，在6d左右達到最大濃度的一半。但本研究只對30d內兔貝伐單抗濃度進行檢測，關于30d后PRP對貝伐單抗在兔眼內的分布和消除的影響，尚待進一步研究。

本研究存在一定局限。兔眼模型與人眼有很多不同點：兔眼玻璃體腔小、晶狀體大、視網膜薄、且無血管化、無中心凹，有學者推測推測視網膜激光光凝治療可能引起血視網膜屏障的破壞[15，16]，因此兔眼PRP對藥物的影響與在人眼中相比，是否存在種屬差異，尚不明確，需要進一步研究證實。