miR-27a rs895819與胃癌臨床病理特征及預后的相關性＊

劉冬蘭，王艷華，廖瑜倩，萬以葉

(江西省腫瘤醫院腫瘤內科，南昌 330029)

全世界每年約有一百余萬例新發胃癌患者，其致死率已排在腫瘤導致死亡原因的第二位[1]。我國胃癌是發病率及死亡率均排名第二位的惡性腫瘤，占全球胃癌的48%，發病最高的地區分布于我國西北及東部沿海區域[2]。胃癌術后有50%以上的患者將出現復發或轉移，這些患者5年生存率僅4-5%[3]，因此術后行輔助化療預防復發轉移，這將具有重要意義。胃癌術后輔助化療藥物主要有兩大類，即鉑類及氟尿嘧啶類[4]。目前我們迫切需要發現一些分子標志物，它將預測胃癌的術后局部復發或遠處轉移，從而指導胃癌的個體化治療。微小核糖核酸（miRNA)是一類大約有20-22個核糖核酸組成的非編碼RNA，它具有高度保守性，且能調節相關基因的表達，逐漸成為新的分子標志物[5，6]。miRNA能降解mRNA或阻礙其翻譯，在其下游信號通路調控蛋白質的表達[7]。微小核糖核酸單核苷酸多態性（miRNA SNP)位于miRNA前體或成熟結構中，它能改變miRNA的數量和質量[8，9]。有研究表明miRNA相關基因的單核苷酸多態性與胃癌的發病有關[10]。目前miRNA-27a rs895819與胃癌發臨床病理特征及生存的研究相對較少。本研究在胃癌術后接受奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶類患者中分miRNA-27ars895819與臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011年1月至2012年12月江西省腫瘤醫院手術的胃癌患者，共98例，均經術后病理證實；通過D2，R0手術切除（ⅠB-Ⅲ期）；術后均接受奧紗利鉑聯合氟尿嘧啶類藥物輔助化療6個月，未接受術前新輔助化放療或輔助放療。

1.2 治療方法 輔助化療方案具體為：⑴84例患者使用mFOLFOX6方案，奧沙利鉑85mg/m2ivgttd1+亞葉酸鈣400mg/m2ivgttd1+氟尿嘧啶400mg/m2ivd1+氟尿嘧啶 2400mg/m2civ46h，Q2W×12次。⑵8例患者使用XELOX方案，奧沙利鉑130mg/m2ivgttd1+卡培他濱 1000mg/m2pod1-14，Q3W×8次。⑶6例患者使用SOX方案，奧沙利鉑130mg/m2ivgttd1+ 替 吉 奧 40-60mgpobidd1-14，Q3W×8次。

1.3 觀察指標 全組患者每3個月進行影像學評價了解患者復發轉移情況，記錄無病生存期及總生存期。

1.4 miRNA SNP檢測方法 全組患者在化療前采集外周血標本5ml。采用Sequenom實驗方法進行SNP分型檢測。具體流程：首先整理SNP序列信息成標準格式；結合文獻并采用AssayDesigner3.1軟件進行引物設計，確定目的位點：5'-ACGTTGGATGGGAACTTAGCCACTGTGAAC -3'（上游引物）和5'-ACGTTGGATGAGGGCTTAGCTG CTTGTGAG-3'（下游引物）；合成引物，引物稀釋，樣本檢測定量；PCR擴增反應；384孔SAP純化反應；384孔單堿基延伸反應，樹脂純化，上機檢測，收集數據。由北京博淼生物公司合成及檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析。采用Kaplan-Meier法進行生存單因素分析，組間比較采用Log-rank檢驗，采用COX分險比例模型進行多因素預后分析。所有的統計檢驗均為雙側概率檢驗。

表1 miRNA-27a rs895819與臨床病理特征的關系

2 結果

2.1 全組患者的基本特征 全組患者男性69例，女性 29例，69例患者年齡＜60歲，29例患者年齡≥60歲。90例患者病灶位于非賁門部（91.8%），8例位于賁門部（8.2%）。27例（27.6%）高分化腺癌，71例（72.4%）低分化及印戒細胞癌。浸潤深度T1-219例（19.4%），浸潤深度 T3-479例（80.6%）；淋巴結轉移69例（70.4%）；37例（37.8%）Ⅰ-Ⅱ期，61例（62.2%）Ⅲ期。

2.2 miRNA-27a rs895819與臨床病理特征的關系miRNA-27a rs895819 基因型（AA，AG，GG)及顯性模型、隱性模型均與胃癌術后臨床特征無相關性。（見表 1）。

2.3 miRNA-27a rs895819及臨床病理特征與無病生存和總生存的關系 ＜60歲患者3年無病生存率為42.19%，≥60歲患者 3年無病生存率為 41.71%。全組患者3年總生存率為73.4%。浸潤深度與3年無病生存率明顯相關。T1-2患者的3年無病生存率明顯高于T3-4，分別為73.53%和32.43%（P=0.011）。臨床分期與3年總生存率顯著相關，Ⅰ-Ⅱ；Ⅲ期患者3年總生存率分別為91.51%和56.92%。基因分型與3年總生存期明顯相關，AA，AG，GG基因型3年總生存期分別為79.55%，74.6%，33.33%（P=0.012）；部位（P=0.56)，分化程度（P=0.160)和N分期（P=0.063)與3年總生存期無明顯相關性。隱性模型中，AA+AG基因型患者的3年總生存率顯著高于GG型，分別為77.22%和33.33%。見表2。COX多因素分析顯示，淋巴結狀態（P=0.014，RR=6.027，95%CI 1.478-32.590) 和rs895819 基因型 （P=0.004，RR=8.281，95%CI 0.025-0.496）為總生存的獨立影響因素。見表3。

3 討論

miR-27a rs895819位于19號染色體短臂上，處于pre-miRNA-27a莖環結構發夾中，會被核糖核酸內切酶（Dicer酶）切割，而影響miRNA-27a前體的成熟[11]。rs895819堿基A＞G突變可縮短莖環結構，阻礙 miRNA-27a 的成熟[12，13]。 miRNA-27a rs895819與惡性腫瘤的發生，發展可能有關。中國學者劉芳騰[14]Meta分析顯示pre-miR-27a基因rs895819多態性與大腸癌易感性之間具有相關性，并且GG突變型具有增加罹患大腸癌的風險。劉春桃等[15]研究顯示miR-27a rs895819基因多態性與宮頸癌發生可能無關。而Sun[16]的研究發現，胃癌的發病風險在rs895819雜合型/突變型（AG/GG）均增加，分層分析發現老年不吸煙的農村男性（＞58歲）發病風險明顯增加，究其原因是rs895819影響了miRNA-27a的表達量；另外發現rs895819雜合型/突變型（AG/GG）與淋巴結轉移明顯相關，與胃癌的發病部位，浸潤深度或腫瘤分級不相關。本實驗結果顯示，miRNA-27a rs895819基因型與胃癌臨床特征不相關，這可能與病例數有關，需要擴大入組患者，在以后的研究中進一步證實。

表2 臨床病理特征、遺傳變異與生存的關系

表3 COX預后多因素分析

Wu等[17]研究顯示，收集的273例胃癌組織中，miR-27a的表達量均高于相對應的癌旁正常組織，miR-27a的表達量增加，促進了胃癌細胞的進一步增殖，遷移，轉移，它是通過Wnt/β-catenin信號通路作用于其靶基因SFRP1而實現其致癌功能的。Ding[18]學者同樣發現，miR-27a表達量在胃癌組織中增高，miR-27a表達增高與胃癌臟器轉移，淋巴結轉移，局部浸潤深度和TNM分期有關，miR-27a通過作用于PHLPP2，激活下游AKT/GSK3β信號通路，最后導致胃癌的增殖及轉移。我們的后續研究將增加病理組織miR-27a表達量的檢測，以明確miR-27a表達量對預后的影響。

Xu[19]臨床試驗得出miR-27a rs895819基因多態性與臨床特征及胃癌的生存均不相關，但在亞組分析中，TNMⅠ-Ⅱ期患者，rs895819雜合型（AG）較野生型（AA）生存具有優勢，在淋巴結轉移及臟器轉移中，攜帶rs895819雜合型和突變型（AG+GG）比純野生型（AA）生存期更長。而我們的研究結果與之不一致，我們得出rs895819純突變型GG較雜合子AG、野生型AA預后均差，其可能與純突變型過表達mir-27a，促進胃癌細胞侵襲和增殖有關，這與既往其他文獻報道結果基本一致。Li J研究[20]結果顯示miR-27a的表達上調，使人肺腺癌細胞對順鉑產生耐藥，miR-27a通過抑制RKIP靶基因，而RKIP可能通過NF-kB/Snail而引起順鉑的耐藥[21]。另有學者[22]對膀胱癌細胞研究顯示，miR-27a抑制靶基因SLC7A11，使腫瘤細胞對順鉑產生耐藥，如果下調miR-27a的表達或用SLC7A11的抑制劑柳氮磺胺吡啶，將能逆轉癌細胞對順鉑藥物的耐藥。另有研究[23]發現miR-27a的表達可能影響白種人5-氟尿嘧啶藥物的代謝，如果既存在miRNA-27a rs895819，又有DPD風險變異，＞70%白種人患者早期將出現嚴重的氟尿嘧啶的毒副反應；而無DPD變異下，miRNA-27a rs895819可能調節Bcl-2蛋白家族中的兩位成員，即Bcl-2和Bax。miR-27a rs895819是否會影響胃癌奧沙利鉑的敏感性及我國5-氟尿嘧啶藥物的代謝目前還不清楚，需要進一步的臨床試驗驗證。

本研究實驗證實，miRNA-27a rs895819A/G基因多態性與胃癌術后病理特征無關，可能與胃癌術后預后相關，野生型+雜合型（AA+AG）患者與純突變型（GG）患者相比，生存期均延長，預后更好。但本研究入組患者有限，可能與真實的結果有一定的偏差，今后還需擴大樣本進一步驗證，并進行更深入的機制研究。