一步法逆轉錄重組酶聚合酶常溫擴增(RT-RPA)技術檢測菜豆莢斑駁病毒

張永江， 魏 霜， 袁俊杰， 乾義柯， 李桂芬， 魏梅生

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176； 2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州 510632； 3.湛江出入境檢驗檢疫局，廣東湛江 524000； 4.伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊寧 835221)

菜豆莢斑駁病毒(bean pod mottle virus，簡稱BPMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)豇豆花葉病毒屬(Comovirus)，其自然寄主為大豆、豇豆、菜豆等豆科植物，實驗寄主多達20屬25種；分布廣泛，在巴西、加拿大、美國、厄瓜多爾、秘魯等大豆產區均發現其危害[1-5]。該病毒通過汁液接觸、介體昆蟲及種子進行傳播，根據侵染程度的不同，能夠造成3%～52%的產量損失并使大豆品質降低[3]，如與大豆花葉病毒(soybean mosaic virus，簡稱SMV)復合侵染，可造成大豆減產85%，其在美國發生嚴重，在我國目前尚未發現分布[6]，已被列入新修訂的植物檢疫性有害生物名單中。我國是全球最大的大豆進口國，近年來，全國多個口岸檢疫部門多次從進境美國、加拿大大豆中截獲BPMV，目前尚無有效的病毒防治方法，一旦BPMV傳入我國并定殖下來，將很難根除，加強出入境檢驗檢疫工作是防止該病毒傳入的有效途徑之一。為保護我國農業生產安全，迫切須要建立一套準確快速的檢測方法應用于進出口快速檢疫。

目前，對BPMV的檢測方法主要有生物學檢測、血清學檢測、電鏡觀察、PCR技術等，近年來多RT-PCR、重RT-PCR、免疫捕獲巢式RT-PCR、環介導等溫擴增等分子檢測技術也被應用于BPMV的檢測[7-11]。PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、可用于大量樣品檢測的特點，然而這種經典的技術需要復雜的溫度循環儀，且檢測時間較長，不符合口岸快速檢測通關的要求。重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，簡稱RPA)技術是近幾年出現的一種有望替代PCR的核酸恒溫擴增技術，在2006年由英國TwistDx Inc公司研發出[12]，該技術主要依賴于3種酶分別為能結合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結合蛋白、DNA聚合酶[13]，反應過程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下完成核酸的快速擴增，產物根據引物設計位點有特定大小的條帶。經探索發現，在RPA體系中加入逆轉錄酶可以將RNA作為模板合成cDNA后再進行擴增，進而實現一步法擴增，利于RNA病毒核酸檢測[14-15]。該技術對設備依賴程度較低，在植物病害診斷、進出口快速檢疫等方面具有巨大的應用前景和市場。目前，國內利用逆轉錄重組酶聚合酶擴增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification，簡稱RT-RPA)技術檢測BPMV的研究尚未見報道，本研究根據BPMV基因組的保守序列，設計特異性RPA引物，建立BPMV的RT-RPA檢測方法，并驗證其特異性和靈敏度，皆在建立一種快速檢測BPMV的簡便高效、特異性強、靈敏度高、適用于口岸快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜豆莢斑駁病毒、南方菜豆花葉病毒(southern bean mosaic virus，簡稱SBMV)、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus，簡稱SMV)、南芥菜花葉病毒(arabis mosaic virus，簡稱ArMV)及煙草環斑病毒(tobacco ringspot virus，簡稱TRSV)大豆種子樣品均保存于中國檢驗檢疫科學研究院，同時設置陰性對照為健康大豆種子，樣品經PCR檢測和序列測定確認后于-80 ℃凍干保存。植物總RNA提取試劑盒為天根生物科技有限公司產品；TwistAmp Basic RT購自TwistDx Inc公司。

1.2 主要儀器與設備

金屬浴(Eppendorf ThermoMixer，由Eppendorf公司提供)、電泳儀(600SI，由上海博彩生物科技有限公司提供)、凝膠成像系統(GBOX-F3，由基因公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 參照試劑盒操作說明，提取5種病毒樣品及陰性對照的總RNA，-80 ℃保存備用。

1.3.2 RPA引物設計 參考RPA引物的設計要求，根據BPMV基因組(GenBank登錄號M62738.1)的保守序列，設計其RPA引物，擴增片段大小為198 bp。上游引物為BPMV-F：5′-TATTTGTATGCTATGGTGCATGATAGTTCAGTGTC-3′；下游引物為BPMV-R：5′-TGTTCTCACTGTTGCCATTTGATTCC-AAAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3 RT-RPA檢測 以“1.3.1”節中制備的總RNA為模板，采用BPMV-F和BPMV-R引物進行RT-RPA擴增，同時設置陰性對照。RT-RPA擴增體系(50 μL)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的反應管中加入再水化緩沖液(rehydration buffer)29.5 μL，去離子水14.0 μL，上、下游引物(終濃度為 0.4 μmol/L)各1.0 μL，模板RNA 2.0 μL，最后再加入醋酸鎂溶液(280 mmol/L)2.5 μL。將RT-RPA擴增體系充分混勻，置于40 ℃金屬浴中反應40 min。RT-RPA反應結束后，向RT-RPA擴增產物中加入50 μL苯酚/四氯化碳溶液，充分混勻后在12 000 r/min的轉鏈下離心2 min，取 5 μL 上清液在 1.5% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，在凝膠成像系統上觀察結果。

1.3.4 RT-RPA檢測方法特異性評價 按照“1.3.3”節 RT-RPA 檢測反應體系，對供試樣品BPMV、SBMV、SMV、ArMV及TRSV共5種病毒的總RNA進行檢測，同時設置陰性對照，對所建立的RT-RPA檢測方法特異性進行評價。

1.3.5 RT-RPA檢測方法靈敏度評價 將BPMV樣品總RNA進行10倍梯度稀釋，共5個稀釋度，以梯度稀釋的RNA為模板，按照“1.3.3”節的反應體系進行RT-RPA靈敏度試驗。

2 結果與分析

2.1 RT-RPA檢測方法的特異性評價

由圖1可知，BPMV樣品能夠檢測到198 bp的特異性條帶，而SBMV、SMV、ArMV、TRSV樣品及陰性對照均未檢測到該條帶，證明該方法具有較強的特異性。

2.2 RT-RPA檢測方法的靈敏度評價

由圖2可知，當稀釋度為10-4時，也可以檢測到約198 bp的目的條帶，當稀釋度為10-5時，未能擴增到目的條帶。

3 結論與討論

RPA技術是一種可使微量核酸在體外恒溫高效快速擴增的新技術，已被廣泛應用于轉基因、病原菌檢測及食品安全等領域[16-20]。與基于PCR的核酸擴增技術相比，RPA技術不需要復雜的溫度循環裝置，操作簡便、反應時間短、特異性強、敏感度高。與其他核酸恒溫擴增方法(如核酸依賴性擴增檢測、環介導恒溫擴增、鏈替代擴增、滾環擴增、依賴解旋酶的恒溫基因擴增及轉錄介導的擴增技術等[21-23])相比，RPA技術不須要完成目標核酸的熱變性，反應時間更短，并且可以多通道同時檢測多個靶基因，檢測擴增產物時可以根據不同的條件選擇恰當的檢測方法，非常實用。當然RPA技術從發展至今才十余年，也存在一些不足：RPA體系運行時，對體系中酶活性的要求較高，任何一種酶失活都能導致反應停止；RPA反應一般在37～42 ℃條件下進行，低溫環境容易出現序列不匹配的產物[24]；RPA體系中，當目的基因含量較低時，引物之間偶爾會形成引物二聚體，可能導致非特異性產物產生[25]；利用瓊脂糖凝膠電泳技術對RPA產物進行檢測時，凝膠成像的結果會受到反應體系中緩沖液等組分的影響，因此須要對產物進行純化處理[26]。

本研究建立的利用RT-RPA檢測BPMV的方法，逆轉錄和RPA恒溫擴增反應在同一反應管中連續進行，操作簡單，制備好RNA后僅須配制反應體系，其后的逆轉錄和RPA擴增過程僅依靠簡單的恒溫裝置即可完成，大大簡化了試驗流程。利用凝膠電泳法檢測其擴增引物，能夠檢測到BPMV的特異性條帶，而其他幾種植物病毒的檢測結果均為陰性，說明RPA方法特異性高，這是因為RPA引物設計原理雖與PCR大體相同，也一樣需要上、下游2條引物，但RPA引物的長度較PCR引物長，通常由30～35個核苷酸組成，這就大大提高了RPA反應中目的基因擴增的準確度。

目前，學者們已經針對BPMV建立了多種檢測方法。張明哲等利用納米上轉換熒光技術檢測BPMV，檢測限度為 1 μg/mL，然而檢測時間需要2.5 h，且磁性納米粒子的制備步驟較為繁瑣，成本高，不適合大范圍推廣[27]；鄧叢良等利用細菌磁顆粒實時熒光RT-PCR檢測BPMV，靈敏度為10-3稀釋度，但是大豆種子中蛋白質和油脂的含量高，細菌磁顆粒對BPMV粒子的吸附效果不佳[28]；易汪雪等利用單管實時熒光RT-PCR方法同時檢測大豆種子中的菜豆莢斑駁病毒和煙草環斑病毒，二者的檢測限度相當，均可達到35 pg/mL，但該方法在樣品中同時含有BPMV和TRSV，且在含量較低時的檢測中比較有優勢[29]；郭立新等利用逆轉錄環介導等溫擴增技術檢測BPMV，靈敏度為200 fg/25 μg，但該技術對引物設計要求較高，需要6條引物才能完成擴增[30]。本研究建立的 RT-RPA 檢測BPMV的靈敏度為10-4稀釋度，該技術檢測時間短，成本低廉，引物設計簡便，僅需1對引物即可完成目的基因的擴增，更適用于核酸快速檢測領域，可作為口岸快速篩查菜豆莢斑駁病毒的有效手段。

4 總結與展望

我國食用油業規模巨大，大豆需求量大，須要長期大量地從國外進口，但其攜帶的多種病毒會威脅我國大豆產業的發展。RPA技術操作方便、特異性強、檢測靈敏度高，擴增產物檢測方便，雖然存在一定的缺點，但隨著RPA技術的不斷發展、進一步完善以及檢測步驟的改良，將有望在BPMV田間診斷、口岸檢驗等領域得到廣泛的應用，為BPMV的快速檢測和一線國門檢疫提供有效的技術支持。