PCR反應程序對土壤微生物PCR-DGGE分析的影響

武麗娟， 陳月星， 劉小鳳， 宋 月， 張戰(zhàn)鳳， 樊永亮

(1.西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100； 2.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，積極參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機質分解及肥力形成等重要的生態(tài)過程[1]。它們的生存很容易受到很多環(huán)境因子的影響，如污染物、地表植被、土地利用方式、土壤類型等，因此常常被認為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的指示者。除了對與土壤微生物密切相關的土壤酶和土壤微生物量的研究外，近年來，對土壤微生物多樣性的研究密集起來，這主要得益于不依賴微生物培養(yǎng)的分子生物學技術[脂肪酸甲酯/磷脂脂肪酸(FAME/PLFA)、擴增的rDNA限制性分析(ARDRA)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)、腸桿菌重復基因間一致序列PCR(ERIC-PCR)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、16S rDNA序列分析]的發(fā)展和DNA測序技術的日益成熟。自Muyzer等將聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術引入到微生物多樣性分析以來[2]，該技術被廣泛應用于檢測各種環(huán)境中微生物群落結構多樣性、監(jiān)測微生物群落動態(tài)變化等方面[3-6]。然而在試驗操作中，該技術各個環(huán)節(jié)均需完善才能準確而科學地反映試驗結果，以往研究主要集中于DNA提取[7-8]、靶序列選擇[9]及變性梯度摸索等方面，而對于PCR反應程序的系統(tǒng)比較研究還未見報道，因此，本試驗針對該技術的目的基因片段擴增(PCR)環(huán)節(jié)，以16S rDNA基因V3區(qū)片段擴增為例，比較4種不同的PCR反應程序對土壤微生物PCR-DGGE多樣性分析的影響，從而評價和篩選出適合于土壤微生物多樣性PCR-DGGE分析的反應程序，以期為PCR-DGGE技術在土壤微生物群落結構和種群多樣性分析中的應用和完善提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗儀器和試劑

儀器：基因擴增儀(美國伯樂公司)，渦旋儀、水浴鍋、高速冷凍離心機(德國艾本德生命科學公司)，核酸突變檢測系統(tǒng)(美國伯樂公司)，核酸電泳儀(美國伯樂公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)，藍盾?621可見光凝膠透射儀。

試劑：小量土壤DNA提取試劑盒(美國Omega公司)、DNA回收純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、瓊脂糖，GenFinder核酸染料(廈門百維信生物科技有限公司)、GelRed核酸染料(美國Biotium生物技術公司)，rTaqDNA聚合酶和dNTPs[寶生物工程(大連)有限公司]，40%丙烯酰胺溶液(丙烯酰胺 ∶甲叉丙烯酰胺=37.5 ∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(西隴)、PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2 研究區(qū)概況和土壤樣品的采集

本試驗所用土樣采集于延安市果業(yè)研究發(fā)展中心蘋果試驗基地，該區(qū)域位于渭北旱塬核心地段，屬于溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年均氣溫9.2 ℃，平均海拔1 100 m，多年平均降水量622 mm，主要集中于6—9月；地貌以塬、梁、溝相間，以塬為主；土壤為黃土母質發(fā)育而成的疏松黑壚土。

于2011年10月19日蘋果成熟期，分別在蘋果生育期內種植三葉草(TrifoliumrepensL.)和覆蓋玉米秸稈(30 000 kg/hm2)的園區(qū)采用多點采樣法采集土樣(地表下5～15 cm土層)，土樣均勻混合后裝入標記好的無菌塑封袋中帶回實驗室，取出石塊、草根、秸稈及其他肉眼可見的雜物，過2 mm鋼篩，于-80 ℃保存，7 d內完成土壤微生物總DNA的提取。

1.3 土壤微生物總DNA的提取

土壤微生物總DNA采用小量土壤DNA提取試劑盒，參照試劑盒操作說明進行提取，得到的DNA提取液經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 16S rRNA基因V3區(qū)片段的擴增

本研究采用引物對27F[10]/1492R[11]和GC-338F/518R[2]分別對16S rDNA基因全長和V3區(qū)片段進行擴增。16S rDNA基因全長擴增體系和程序參照Nicomrat等的方法[12]；V3區(qū)片段擴增體系如下：10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(各 5 μmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，TaKaRa rTaq(5 U/μL)0.5 μL，補充雙蒸水至50 μL。反應程序為

A：降落式PCR。以提取的微生物總DNA為模板，進行V3區(qū)片段擴增，參考Kihara等的方法，反應條件為94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 變性30 s，65～55 ℃(每個循環(huán)退火溫度降低 0.5 ℃，直至退火溫度降至55 ℃)復性30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸 1 min，10個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[13]。

B：巢式-降落式PCR。以27F/1492R引物擴增產物為模板，進行V3區(qū)片段擴增，反應程序同A。

C：普通PCR。以提取的微生物總DNA為模板，進行V3區(qū)片段擴增，參考Kimura等的方法，反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min[14]。

D：巢式PCR。以27F/1492R引物擴增產物為模板，進行V3區(qū)片段擴增，反應程序同C。

每個土樣PCR均設置3個重復，合并后采用瓊脂糖凝膠DNA回收和純化試劑盒進行回收純化，依據試劑盒使用說明進行操作，濃縮產物保存于-20 ℃，以備DGGE分析。

1.5 DGGE分析

應用美國伯樂公司核酸突變檢測系統(tǒng)進行DGGE分析，凝膠的變性梯度為45%～65%(100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物)，凝膠濃度為8%，在60 ℃、120 V條件下，凝膠在1×TAE緩沖液中電泳510 min。電泳完畢，將凝膠浸在含Gel Red(體積分數為1 ∶10 000)的 1×TAE 溶液中避光染色10～15 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.6 數據分析

應用Quantity One 4.6.2軟件對DGGE圖譜進行數字化分析，用以計算香農指數(H)、豐富度指數(R)、均勻度指數(E)和戴斯系數(D)，并利用SPPSS 16.0軟件應用單因素方差分析方法檢測處理間的差異顯著性。相關指數計算公式如下：

(1)

E=H/lnS；

(2)

(3)

式中：Pi為某一條帶的峰強度與該泳道中所有條帶峰強度和的比值；S為某一泳道的DNA條帶數。Sx為泳道x中的條帶數；Sy為泳道y中的條帶數；Sc為泳道x和泳道y所共有的條帶數。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物總DNA提取和16S rDNA V3區(qū)擴增

2.1.1 土壤微生物總DNA提取 本試驗采用土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，所提取的DNA溶液D260 nm/D280 nm介于1.8～2.0之間，其D260 nm/D230 nm介于0.1～0.5之間；經8%瓊脂糖凝膠電泳后得到單一、清晰的條帶，大小約為23 kb，說明所提取的DNA溶液在純度和長度上均滿足后續(xù)試驗的要求。

2.1.2 PCR擴增結果 應用通用引物對27F/1492R擴增16S rDNA基因全長，并經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可知，通過應用27F/1492R引物對的擴增，2份土樣均成功擴增出16S rDNA基因的全長序列，長度約為1 500 bp。將擴增得到的3份PCR反應液進行合并，經DNA回收純化試劑盒回收純化后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

應用同樣的反應體系，不同的反應程序擴增16S rDNA基因V3區(qū)片段，并經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖2-A和圖2-B可知，用4種不同的PCR反應程序，2份土樣的所有處理樣品均擴增出正確大小的目的片段，約為220 bp；重復之間和不同反應程序之間，電泳條帶的大小和強度沒有明顯差異，而在2份土樣之間，植草覆蓋果園土樣(G)比秸稈覆蓋果園土樣(S)亮度暗。同一處理的PCR反應液合并后經DNA純化回收試劑盒回收純化，于-20 ℃冰箱保存，以備DGGE分析。

2.2 DGGE圖譜分析

應用PCR-DGGE分析自然環(huán)境中細菌、古菌、真核生物及病毒群落的生物多樣性，通過添加化學變性劑使DNA在電泳過程中發(fā)生解鏈變性，降低遷移率，從而使不同DNA分子得以分離。理論上，DGGE圖譜上1個條帶代表1個微生物優(yōu)勢菌群或操作分類單，條帶數目的多寡反映細菌的多樣性高低，對應條帶的強度反映該優(yōu)勢菌群的相對豐度，因此可以依據圖譜中的條帶信息分析樣品中微生物的群落結構和微生物種群多樣性。

4種不同PCR反應程序下土壤微生物多樣性DGGE指紋圖譜見圖3，通過對DGGE圖譜的初步分析，可以發(fā)現，2個土樣DGGE圖譜中的各泳道的條帶數目比較豐富、遷移率及條帶亮度間存在一定差異，說明2份土樣所含微生物多樣性較高，且樣品間微生物種類和數量差異較大；同時2個土樣圖譜中存在若干共同條帶，說明供試土樣中存在多種共有細菌；樣品內不同反應程序處理間各泳道的條帶數目、亮度及遷移率也存在一定差異，說明不同的PCR反應程序對DGGE多樣性分析存在一定的影響，且明顯可以看出，A與B、C、D差異較為明顯，而B、C、D之間條帶類型較為相似。

2.3 不同PCR反應程序下細菌群落結構分析

應用Quantity One 4.6.2軟件對DGGE圖譜進行數字化處理，并計算樣品中各泳道的多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數。由表1可知，2個土樣不同處理間多樣性指數相似，A處理的多樣性指數最低，與B處理間差異顯著(P<0.05)；B、C、D處理多樣性指數均大于等于3.10，且C、D處理間無顯著差異。豐富度指數與多樣性指數比較結果相似，2個土樣中A處理的豐富度最低，分別為25(G)和24(S)，且與C、D處理間差異顯著(P<0.05)，B、C、D豐富度指數無顯著性差異。結果表明，單純應用降落式PCR在提高擴增特異性的同時降低了擴增效率，從而導致DGGE圖譜條帶數目較少，反映樣品中微生物種群多樣性較低；在巢式-降落式PCR、普通PCR和巢式PCR擴增條件下，DGGE圖譜多樣性較好、豐富度指數較高， 能夠較好地反映土壤微生物的群落結構和種群多樣性，并且表現出較好的一致性。

表1 不同PCR反應程序下土壤微生物多樣性指數

注：同列數據后不同小寫字母表示經Duncan’s檢驗在0.05水平上差異顯著。A表示降落式PCR；B表示巢式-降落式PCR；C表示普通PCR；D表示巢式PCR。下表同。

2.4 群落相似性分析

DGGE圖譜經Quantity One 4.6.2軟件分析，通過戴斯系數公式計算2份土樣在4個不同PCR反應程序下各泳道的戴斯系數，得到相似性矩陣(表2、表3)。2個土樣中降落式PCR與其他3個處理相似度普遍較低，最低為0.78；普通PCR與其他3個PCR處理相似度比較低，主要因為普通PCR在擴增復雜模板時存在一定的非特異性擴增，表現在DGGE圖譜上為出現不代表任何細菌種群的特異條帶，從而夸大樣品中微生物的種群多樣性和豐富度；巢式-降落式PCR和巢式PCR處理間一致性較高，具有相似的微生物群落結構，尤其S的巢式-降落式PCR和巢式PCR處理反映的土壤微生物群落結構基本一致，相似度為0.97，說明巢式PCR不僅確保了擴增的特異性，且克服了降落式PCR擴增效率低的問題。

表2 不同反應程序下植草覆蓋果園土壤樣品微生物群落結構相似性分析

表3 不同反應程序下秸稈覆蓋果園土壤樣品微生物群落結構相似性分析

3 討論

DGGE凝膠電泳技術于1979年被提出，是一種用于DNA突變檢測的分子生物技術[15]，該技術被Muyzer等[2]引入到微生物生態(tài)學研究領域，并證實了該技術在自然界微生物生態(tài)學研究領域的實用性和優(yōu)越性。這是因為(1)DGGE是一種不依賴于純培養(yǎng)的DNA片段分離技術，能夠較全面反映樣品中微生物的群落結構、種類和數量；(2)DGGE凝膠電泳可以同時運行多個樣品，適用于研究環(huán)境樣品中微生物群落結構的演替規(guī)律、種群動態(tài)變化等；(3)DGGE凝膠電泳具有重現性高、可靠性強及操作簡單等優(yōu)點，因此DGGE自誕生以來被廣泛應用于各種環(huán)境(土壤、活性污泥、生物膜、動物腸胃以及水生生態(tài)環(huán)境)微生物多樣性的檢測及群落動態(tài)變化規(guī)律的研究。

然而，與其他分子生物技術一樣，DGGE技術也存在一定的局限性，如只能分離500 bp以下的DNA片段，序列信息量較小；具有相同解鏈行為的微生物DNA序列在DGGE圖譜上遷移率一致，無法準確區(qū)分；DGGE只能檢測環(huán)境中優(yōu)勢菌群的種類和數量(1%以上)，且無法提供代謝活性和基因表達水平方面的信息。除此之外，DGGE圖譜分析還受到各操作環(huán)節(jié)的影響，包括總DNA的提取、PCR擴增引物選擇、凝膠和變性劑梯度的設置、電泳溫度和時間的確定、染色方法的選擇[16-17]以及后續(xù)條帶的測序步驟[18]。

本研究針對PCR擴增環(huán)節(jié)，采用目前DGGE分析中比較常用的4種擴增程序(A：降落式PCR；B：巢式-降落式PCR；C：普通PCR；D：巢式PCR)對16S rDNA基因V3區(qū)進行擴增，并進行DGGE圖譜分析，結果表明，與普通PCR和降落式PCR相比，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)所獲得的DGGE條帶較為清晰，條帶數目較豐富。雷娟利等在研究不同蔬菜連作對土壤細菌DNA分子水平多態(tài)性影響中也發(fā)現，巢式PCR所獲得的DGGE條帶比直接PCR更清晰，可分辨的條帶數量也更多[19]。同樣，江蕓等在研究真空包裝冷卻豬肉冷藏過程中菌相變化時發(fā)現，巢式PCR(巢式-降落式PCR)能夠增加PCR反應的靈敏性[20]。表明在其他技術操作相同的情況下，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)比其他PCR更適用于土壤及其他微生物群落結構比較復雜的樣品的PCR-DGGE分析。

然而，PCR只是PCR-DGGE技術流程的一個環(huán)節(jié)，保證PCR擴增的特異性和效率是整個試驗的一部分，其他環(huán)節(jié)對DGGE圖譜分析同樣也存在一定影響，因此，在應用PCR-DGGE技術對土壤微生物群落結構進行分析時，須摸索和完善各個環(huán)節(jié)才能得到全面和科學的結果。

4 結論

綜上所述，應用PCR-DGGE分析土壤微生物群落結構和種群多樣性時，不同的PCR反應程序獲得的DGGE圖譜分析結果存在明顯差異。本試驗結果表明，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)反應處理下的DGGE圖譜條帶豐富，多樣性高，能夠比較全面和科學地反映樣品中微生物群落結構和種群多樣性。