不同酶液組合對椪柑原生質體分離的影響

周一鵬， 何 麗， 羅 麗， 許曉玲， 徐小勇

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009)

原生質體指采用酶解法或機械法去掉細胞壁的裸露活細胞，在一定條件下可以發育成完整的植株，同時，原生質體也是一種理想的單細胞系統[1]。因此，原生質體可以為現代生物技術研究的諸多方面提供有利的試驗材料，已被廣泛地應用于植物基礎理論研究和遺傳改良中[2-3]。然而，原生質體技術應用的首要前提是分離出高質量的原生質體。由目前的研究現狀可知，影響原生質體分離的因素主要有分離起始材料、預處理、酶液組合和濃度、酶解時間、滲透壓等。其中，酶液組合是影響原生質體分離成敗的關鍵因素之一[4-5]。

目前，人們廣泛使用的酶液組合為纖維素酶+離析酶或纖維素酶+果膠酶，已被成功地用于小麥、馬鈴薯、油菜、柑橘等植物的原生質體分離[6]。另外，值得注意的是，不同來源的纖維素酶對原生質體分離也有影響。研究發現，相對于非純化的纖維素酶，純化的纖維素酶用于煙草和葡萄原生質體分離時，可降低活性氧水平，提高分離效果[7-8]。柑橘原生質體主要由愈傷組織和葉片分離而來，所使用的酶液組合皆為纖維素酶R-10+離析酶R-10，然而纖維素酶R-10是一種非純化的纖維素酶。本研究擬采用純化的纖維素酶Worthington+離析酶R-10的酶液組合與常規酶液組合進行椪柑原生質體的分離，比較它們在原生質體酶解時間、產量及活性氧含量上的差異，從而分析纖維素酶純化與否對椪柑原生質體分離的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將椪柑(CitrusreticulataBlanco)胚性愈傷組織保存于MT基本培養基中，每20 d繼代1次；將愈傷組織用懸浮培養基(MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖)懸浮培養4代后用于原生質體的分離。

取新鮮椪柑果實，去掉果肉，將種子用水沖洗干凈，用 1 mol/L NaOH浸泡10min，去掉果膠，轉入超凈工作臺內，用無菌蒸餾水沖洗后，再用75%乙醇浸泡10 min，然后用1% NaClO溶液消毒20 min，再然后用無菌蒸餾水沖洗3次，每次5 min。最后用滅過菌的手術刀片剝去內外種皮，接種到MT培養基上，大約過30～40 d，待葉片充分展開后用于原生質體分離。

1.2 主要試劑

主要試劑有蔗糖、甘露醇、瓊脂粉、嗎啉乙磺酸(MES)、纖維素酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、纖維素酶(Worthington Biochemical Corporation)、離析酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、麥芽提取物、NaH2PO4、CaC12·2H2O、CPW13(含13%甘露醇的細胞-原生質體清洗液)、CPW26(含26%蔗糖的細胞-原生質體清洗液)、活性氧檢測試劑盒。

1.3 試驗方法

1.3.1 椪柑原生質體的分離 原生質體的分離參照何麗等的方法[9-10]，稍作修改。

愈傷組織原生質體的分離。取3 g愈傷組織于培養皿中，加入2 mL 0.7 mol/L EME培養基(MT+0.7 mol/L蔗 糖+0.5 g/L ME)中，再加入2 mL酶液(含2%纖維素酶R-10或纖維素酶Worthington+2%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值為5.8)。將培養皿用封口膜封口，于28 ℃暗條件下酶解24 h，酶解過程中每隔一段時間觀察原生質體的分離情況，以確定最佳酶解時間。

葉肉原生質體的分離。取出試管苗的葉片，置于鋪有濾紙的無菌培養皿中，用手術刀片將葉片切成1～2 mm寬的條狀，之后放入預先加了2 mL左右0.6 mol/L EME(配方為 MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME)的培養基中，最后加入 2 mL 酶液(含2%纖維素酶R-10或纖維素酶Worthington+2%離析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值為5.8)。將培養皿用封口膜封口，于28 ℃黑暗條件下酶解24 h，其間每隔一段時間觀察原生質體分離情況。

將酶解完成后的原生質體(酶解混合物)通過孔徑為 45 μm 的不銹鋼篩網過濾，并用CPW13沖洗，之后將濾液轉移到10 mL離心管中，于950 r/min離心10 min，去上清。將原生質體沉淀與2 mL CPW13混勻，之后用吸管輕輕轉移到預先加入6 mL CPW26的離心管中，于930 r/min離心2 min，經CPW13/CPW26界面梯度離心純化后，用吸管將2個液面間的原生質體帶吸出。將純化后的原生質體懸浮于電融合液(含12.7%甘露醇+0.03% CaC12)中備用。

1.3.2 椪柑原生質體產量的測定 采用血球計數板進行原生質體產量的測定。先將蓋玻片蓋在計數室上，將原生質體懸浮液滴在蓋玻片一側邊緣，使其沿著蓋玻片和計數板間的縫隙滲入計數室，直到充滿計數室為止。依次逐個計數中央大方格內25個中方格里的原生質體數，然后根據下式計算原生質體產量：

1 mL懸浮液中的原生質體數=1個大方格懸浮液中的原生質體數×104；

原生質體產量(個/g)=原生質體密度(個/mL)×原生質體懸浮液的總體積(mL)/葉片質量(g)。

1.3.3 椪柑原生質體中活性氧含量的測定 采用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)測定原生質體中的活性氧含量。按照1 ∶1 000的比例，用原生質體培養液稀釋2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，使其終濃度為10 μmol/L。將原生質體收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，使原生質體濃度為106～107mL，于37 ℃水浴鍋內孵育 20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，使探針和原生質體充分接觸。之后，用原生質體培養液將處理好的原生質體洗滌3次，以充分除去未進入原生質體內的DCFH-DA。最后設置1個對照管，按照體積比1 ∶1 000的比例加入陽性對照Rosup，并設置1個未加DCFH-DA的陰性對照。做好前處理后，于 30 min 內上樣，用FACSAria流式細胞儀進行檢測。

1.3.4 數據分析 試驗重復3次，采用Excel 2003計算平均值和標準偏差，采用SPSS進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同酶液組合對原生質體酶解時間的影響

對于不同的酶液組合或酶解材料，其酶解時間一般也不同，因此在酶解過程中要進行持續觀察，當觀察到原生質體數量不再增多時，可停止酶解，開始后續試驗，該階段時間可視為適宜的酶解時間。本研究首先觀察了酶液組合Ⅰ(纖維素酶R-10+離析酶R-10)和酶液組合Ⅱ(纖維素酶Worthington+離析酶R-10)對2種外植體酶解時間的影響。結果表明，對于愈傷組織或葉片，2種酶液組合所需的酶解時間均存在差異(圖1)?？傮w而言，酶液組合Ⅰ所需的酶解時間較長，分別為18 h(愈傷組織)、20 h(葉片)；酶液組合Ⅱ所需的酶解時間則分別為6 h(愈傷組織)、16 h(葉片)。上述結果表明，采用純化纖維素酶的酶液組合可以縮短酶解時間，從而提高原生質體的分離效率。

2.2 不同酶液組合對椪柑原生質體產量的影響

原生質體產量是衡量原生質體分離效果的重要指標。因此，本研究測定了2種酶液組合條件下原生質體的產量。如圖2所示，酶液組合Ⅱ所獲得的原生質體產量均比酶液組合Ⅰ高，且差異顯著。酶液組合Ⅱ處理的愈傷組織原生質體的產量為酶液組合Ⅰ的9.09倍，酶液組合Ⅱ處理的葉肉原生質體產量為酶液組合Ⅰ的5.29倍。由此可見，酶液組合Ⅱ能較大地提高原生質體產量，從而為后續的原生質體操作，如細胞融合、轉化或分子生物學研究提供了量的保證。

2.3 不同酶液組合對椪柑原生質體活性氧水平的影響

水稻、油菜、煙草和葡萄等植物的原生質體在分離過程中會產生活性氧[7，11-13]，而過多的活性氧積累會影響原生質體的再生。此外有研究表明，纖維素酶的純度會影響原生質體的活性氧水平[7]。因此，本研究采用活性氧檢測試劑盒測定了2種酶液組合條件下剛分離時原生質體的活性氧水平。結果發現，酶液組合Ⅰ中的愈傷組織原生質體的活性氧水平是酶液組合Ⅱ的1.96倍，且差異顯著；對于葉肉原生質體，2種酶液組合間差異不顯著(圖3)。

3 結論與討論

植物原生質體的分離涉及到細胞壁的去除，而這個過程需要借助一些酶制劑來完成。常用的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、離析酶、果膠酶等。其中，纖維素酶可以降解細胞壁的主要成分纖維素，其純度和活力的高低直接影響原生質體的分離效果。本研究比較了酶液組合Ⅰ(纖維素酶 R-10+離析酶R-10)和酶液組合Ⅱ(纖維素酶Worthington+離析酶R-10)對椪柑原生質體分離的影響。結果表明，酶液組合Ⅱ在原生質體酶解時間和產量方面均明顯優于酶液組合Ⅰ。因此可見，酶液組合Ⅱ更適合椪柑原生質體的分離。

對于這2種酶液組合在分離原生質體上的差異，可能有以下2個原因：一是酶液組合中的2種纖維素酶在酶活性上存在差異。纖維素酶R-10又稱1，4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，來源于綠色木霉，含有降解天然纖維素的活性，1 mg酶制劑含有10 U酶活性單位；纖維素酶Worthington來源于里氏木霉，具有外切、內切葡聚糖酶活性，能夠有效水解纖維素，1 mg酶制劑含有140 U酶活性單位。在同等濃度的條件下，纖維素酶Worthington降解細胞壁纖維素的速度更快，所需的酶解時間也就越短。二是2種纖維素酶在純度上存在差異。纖維素酶Worthington是通過色析法純化而來的，在純度上遠高于纖維素酶R-10。已有研究表明，非純化的酶在原生質體酶解時易引起細胞損傷，而純化的纖維素酶能減少活性氧含量，有助于原生質體的分離[7，11]，本研究也得到相似的研究結果?？傮w可以看出，純化的纖維素酶Worthington可高效地分離椪柑原生質體，對于其他植物原生質體的分離具有重要的參考價值。