三黃瀉心湯及其有效組分對大鼠的總膽汁酸代謝影響

劉巧，李奇娟，謝余，高玉蓮，王戰軍，胡慧玲，王戰國

三黃瀉心湯始載于張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩三味中藥組成，用于治療“心氣不足，吐血釁血”血熱證的代表方劑，具瀉火解毒，清熱燥濕等功效[1～3]。膽汁酸在消化中調節腸道微生物群，調節膽固醇、脂質和葡萄糖體內平衡所必需的途徑中起重要作用[4]。膽汁酸代謝反映了腸道菌群的代謝穩定性，反映了肝-腸循環的藥物代謝過程[5～6]。研究表明，大黃中大黃素可通過降低總膽汁酸來治療膽汁淤積[7～9]，而對于三黃瀉心湯及其有效組分對于總膽汁酸的代謝影響尚未明確報道。因此，本課題對瀉心湯及其有效成分不同配伍組分對大鼠在24 h內的總膽汁酸代謝影響進行了研究，以期找出藥物對大鼠血清總膽汁酸（Total bile acid, TBA）分泌的影響，為后期的病理模型研究和臨床上膽汁酸代謝性疾病的研究奠定一定的基礎。

1 實驗材料與儀器

1.1 試藥

大黃素（長沙中仁生物科技有限公司，批號：161022，純度＞98%），鹽酸小檗堿（長沙中仁生物科技有限公司，批號：161102 ，純度＞97%），黃芩苷（長沙中仁生物科技有限公司，批號：161105，純度＞95%）；大黃藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：161010），黃連藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：170330），黃芩藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：160827），經鑒定，藥材各項指標均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規定項下要求。大鼠血清總膽汁酸（TBA）酶聯免疫分析試劑盒（上海盈公實業有限公司，批號：20170708）。

1.2 儀器

TGL-16C型離心機（上海安亭科學儀器廠）；BT125D電子天平（德國賽多利斯）；352型酶標儀（Labsystems Multiskan MS）。

2 試驗方法

2.1 TBA測定原理

TBA試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠總膽汁酸（TBA）水平。用純化的大鼠總膽汁酸（TBA）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入總膽汁酸（TBA），再與HRP標記的總膽汁酸（TBA）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的總膽汁酸（TBA）呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠總膽汁酸（TBA）濃度。

2.2 樣品溶液的制備

所有分組灌胃給藥體積為4 mL/只，按2015年版《中國藥典》[1]中三黃片量擴大10倍計算。灌胃溶液的具體配制方法如下：

2.2.1 大黃素灌胃液的配制

取大黃素40 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得濃度約為0.8 mg﹒mL-1的大黃素灌胃溶液。

2.2.2 大黃素+鹽酸小檗堿配比灌胃液的配制 取大黃素40 mg、鹽酸小檗堿120 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得。

2.2.3 大黃素+鹽酸小檗堿+鹽黃芩苷配比灌胃液的配制 取大黃素40 mg、鹽酸小檗堿120 mg、黃芩苷360 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用2.5 mL乙醇溶解（超聲溶解）后，加生理鹽水稀釋至刻度線，即得。

2.2.4 三黃瀉心湯合煎液的制備 取大黃粉末60 g、黃連粉末30 g、黃芩粉末30 g（過四號篩），精密稱定，以上三味，加入10倍量純水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁熱濾過，即得煎煮液約400 mL。

2.3 實驗動物分組及給藥劑量

30只雄性SD大鼠，體重250 g左右，隨機分為A、B、C、D、control五組，每組6只，A組：大黃素+鹽酸小檗堿+黃芩苷配比組； B組：大黃素+鹽酸小檗堿配伍組；C組：大黃素組；D組：三黃瀉心湯組；Control組：空白生理鹽水組。實驗前適應飼養一周，給予標準光照周期（14 h光照、10 h黑夜），實驗室溫度維持在20～25 ℃，相對濕度控制在70 %左右。實驗前給予自由飲水并禁食12 h，試驗當天早晨稱重，按預定劑量給藥4 mL/只。

2.4 大鼠血清的收集及測定方法

實驗前，先收集空白血清0.5 mL，然后分別灌胃給予各組設計給藥劑量，隨后于灌胃后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h采用大鼠斷尾取血法收集血液0.5 mL，室溫靜置30 min后，以12000 r﹒min-1離心10 min，取上層血清，于-80 ℃ 凍存，備用。

按照TBA試劑盒說明書的操作說明，首先分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。然后將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。隨后用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。隨后小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液（將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后用），靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。隨后每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃ 溫育30 min。洗滌5次。然后每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃ 避光顯色10 min。最后，每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），測定在15 min以內完成。

2.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件，數據用（ S）表示，計量資料先進行正態檢驗，正態分布資料采用單因素方差分析，非正態分布資料先轉換成正態分布再用單因素方差分析。進行組間比較，P＜0.05為數據統計有顯著性差異。

3 試驗結果

3.1 標準曲線的建立

精密吸取試劑盒中標準品溶液稀釋成相應濃度（20、10、5、2.5、1.25、0 μmoL﹒L-1），按“2.4 大鼠血清的收集及測定方法”測定，以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。線性方程為：y=11.8721x-0.2815，r=0.9987，結果表明標準品在0～20 μmoL﹒L-1范圍內呈良好線性關系，可用于后期血清樣品中TBA的檢測。

圖1 標準曲線圖

3.2 三黃瀉心湯及其有效組分對大鼠的總膽汁酸代謝影響

根據樣品的OD值由標準曲線計算出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品中總膽汁酸（TBA）實際濃度。結果見表1和圖2。

表1 三黃瀉心湯及其有效組分灌胃大鼠24 h內總膽汁酸的濃度 (S, 單位:μmol﹒L-1;n=6)

圖2 三黃瀉心湯及其有效組分對大鼠的總膽汁酸代謝影響差異(單位：μmol﹒L-1；n=6)

以上結果表明各組之間與空白組對比，經SPSS 21.0分析，組間具有顯著性差異（P＜0.05）。經對比分析數據，正常大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后0～2 h、4～10 h血清膽汁酸呈一定的降低趨勢，TBA變化趨勢整體比對照組平緩。其中：A組（大黃素+鹽酸小檗堿+黃芩苷配比組）和B組（大黃素+鹽酸小檗堿配伍組）在24 h內表現出相似的TBA變化趨勢，而單獨灌胃大黃素（C組）或中藥復方三黃瀉心湯（D組）大鼠后，TBA變化趨勢與A組和B組變化有所不同，具體表現為6 h這個時間點呈升高趨勢，且與空白組具有較大差異。D組（三黃瀉心湯組）變化趨勢較對照組最大，對TBA的降低作用表現最大。

3 討論

3.1 三黃瀉心湯及其有效組分對正常大鼠的總膽汁酸代謝影響

健康成人膽汁酸儲存量大約為3～4 g。膽汁酸貯存庫每天大約循環8～12次，主要發生在進餐后。人體每天膽汁酸合成量大約為0.4～0.6 g，用于補償膽汁酸隨糞便排出而造成的損失。有文獻報道[10]，人體中血清總膽汁酸的變化是隨不同時間變化而變化的。正常大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后24 h內血清TBA表現出組間差異，并總體表現出血清膽汁酸降低的趨勢。在灌胃后2 h內，還有3 h、5 h、8 h、12 h這幾個時間點表現出較大的差異，正常組表現為變化較大，而給藥后TBA變化較平緩。這可能與三黃瀉心湯及其有效組分可促進總膽汁酸的排泄有關。本課題后期將收集正常大鼠給藥后24 h內糞便，進行TBA的檢測分析，以確證這個猜想。

經對比分析數據，A組和B組在24 h內表現出相似的TBA變化趨勢，在0～1 h、2～4 h、4～6 h、8～10 h與空白組具有較大差異；而單獨灌胃大黃素或中藥復方三黃瀉心湯灌胃大鼠后，TBA變化趨勢與A組和B組變化有所不同，具體表現為1～3 h、4～6 h、8～12 h與空白組具有較大差異。分析可能是因為灌胃不同藥物對膽汁酸的影響造成血清TBA的變化，這對后期與膽汁酸代謝相關的疾病病理模型研究中時間點的選擇和藥物選擇提供一定的依據。

3.2 三黃瀉心湯及其有效組分對大鼠的總膽汁酸代謝影響具有臨床指導意義

膽汁酸是膽固醇的最終產物并且是消除人體多余的膽固醇的主要途徑之一。通過與多藥轉運蛋白的直接接觸，膽汁酸可能受到藥物轉運的影響。膽汁酸是膽固醇的最終產物并且是消除人體多余的膽固醇的主要途徑之一。已經有文獻報道[11]，血清膽汁酸可通過激活特異性核受體調節葡萄糖、脂肪酸、脂蛋白的合成、代謝、轉運和能量代謝。因此，本課題采用三黃瀉心湯及其有效組分對正常大鼠血清TBA的代謝影響，可為后期的與膽汁酸相關的疾病或肝膽代謝性疾病的研究奠定一定的參考基礎。

已經有學者[10]探究了正常人體血清TBA和7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮（7a-hydroxy-4-cholesten-3-one,C4）的晝夜變化規律，研究結果表明血清TBA在進餐后1 h和5 h濃度達到峰值，這與共軛膽汁酸變化規律一致；C4的變化與進餐無關，與晝夜節律相關，主要3 h和12 h達到峰值，這與非共軛膽汁酸變化規律一致。C4是由膽固醇生物化學合成膽汁酸的中間體。它的前體7α-羥基膽固醇由膽固醇通過肝膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）產生。血清C4濃度反映膽汁酸的合成途徑。由于膽汁酸合成速率具有晝夜節律，因此血清C4值在一天中也變化。然而文獻報道的膽汁酸變化時間節點與本課題中大鼠灌胃三黃瀉心湯及其有效組分后血清TBA變化規律的內在聯系需進一步的實驗探索。