細菌內毒素多次給藥對家兔致熱靈敏度影響的研究

晏成倩，趙璐，王紅平，易恒，黃梅梅，黃明，曾南

家兔熱原檢查作為藥品質量控制的一種重要手段，能直觀反映各種熱原對生物體的致熱特點和程度。影響家兔熱原檢查結果的因素很多，家兔的敏感性是其中一個很重要的因素。2015 年版 《中國藥典》四部通則中熱原檢查法不限定家兔的使用次數[1]，但對使用多次的家兔和休息后的高溫兔進行靈敏度檢查，能提高實驗的準確性和重復性，對規范熱原檢查具有非常重要的意義。因此通過以下實驗探討細菌內毒素多次給藥對家兔致熱靈敏度的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

新西蘭兔，普通級，雌雄兼有，體重2.1～3.5 kg，由四川省實驗動物專委會養殖場提供，動物生產許可證號：SCXK（川）2013-14。飼養條件：溫度20 ℃～26 ℃，相對濕度40 %～70 %，12 / 12小時明暗交替照明。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品（CSE，中國藥品生物制品檢定研究院，規格：80 EU/支，批號：150601-201784）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，規格：50 mL，批號：17033005）；氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：G117062804）

細菌內毒素溶液配制：用細菌內毒素檢查用水溶解細菌內毒素工作標準品，于渦旋混合器上混勻15 min，然后使用氯化鈉注射液進行稀釋，最終稀釋至2個濃度1 EU﹒mL-1、0.5 EU﹒mL-1、0.25 EU﹒mL-1。

1.3 儀器

ZRY-2D型智能熱原儀（天津市天大天發科技有限公司）；MS3 型旋渦混和器( 德國 IKA 公司)；OMH 180 SS 型高溫烘箱( Thermo Scientific Heratherm)；試驗所用器皿均經250 ℃烘烤2 h去除外源性細菌內毒素。

2 實驗方法

按照 2015 年版 《中國藥典》 四部通則熱原檢查法規定進行新兔挑選。熱原檢查前進行基礎體溫測定，取符合熱原檢查法規定的家兔36只，隨機分成3個組，每組12只。分別給予10 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1、2.5 EU﹒kg-1的細菌內毒素劑量，每組注射體積均為10 mL﹒kg-1。每組家兔共注射4次細菌內毒素標準品溶液，每次間隔17 d。給藥后每隔30分鐘測量一次體溫，共測量6次。若第2、3、4次熱原檢查前進行基礎體溫測定時，有家兔不符合規定則將其淘汰。記錄每組家兔每次給藥的動物數，計算平均最大升溫值（降溫均以0℃計）、升溫率（最大升溫≥0.6 ℃的動物數/動物數）和入選率（入選動物數/動物數）。

3 實驗結果

實驗結果顯示，每次給藥后，家兔在1.5 h左右升溫可達到最大值，各組升溫幅度隨細菌內毒素劑量的增加而增大，組間有明顯統計學差異（P＜0.05或0.01），其中5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的平均升溫均超過0.6 ℃，升溫率超過60 %，熱原反應呈陽性結果，而隨著給藥次數的增加，同一劑量組的平均升溫未產生明顯變化，而家兔入選數則減少。同時家兔入選率還與細菌內毒素劑量呈明顯相關性，劑量越大，入選率越低，其中以10 EU﹒kg-1表現尤為顯著，從最初12只到第2次給藥9只，再到第3次給藥8只，最后第4次給藥僅4只。另外，詳見表1、表2和圖1、圖2。

表1 各組家兔注射細菌內毒素后體溫平均升溫值及升溫率

表2 各組家兔注射細菌內毒素的入選動物數及入選率

圖1 不同劑量的細菌內毒素致家兔體溫升高情況圖

圖2 各劑量組家兔入選數量變化圖

4 討論

《中國藥典分析檢測技術指南》建議采用5 EU﹒kg-1（或10 EU﹒kg-1）內毒素劑量按熱原檢查法對家兔進行靈敏度考核驗證，故本實驗選擇2.5 EU﹒kg-1、5 EU﹒kg-1和10 EU﹒kg-1的細菌內毒素作為多次給藥的劑量。另外藥典規定升溫達0.6 ℃的家兔應休息2周以上，考慮到家兔體重增長和藥典規定3周內未曾使用的家兔應在檢查供試品前7日內進行預測體溫，所以每次間隔17 d給藥。

從首次給藥看，家兔最低靈敏度可達到5 EU﹒kg-1，注射劑人每千克體重每小時最大可接受細菌內毒素劑量為5 EU﹒(kg﹒h)-1，所以在考察家兔靈敏度時，應把5 EU﹒kg-1作為最低檢測限。另外，因為10 EU﹒kg-1劑量能致家兔接近100 %發熱，更適合在注射劑進行適用性考察時使用。

文獻報道，家兔短期內多次接觸細菌內毒素劑量可產生耐受性，降低其對熱原物質的靈敏度，造成假陰性結果[3～6]。同時藥典規定供試品判定為不符合規定，則組內全部家兔不再使用。但在本實驗中各劑量組家兔每次給藥后平均升溫值變化不大，表明注射細菌內毒素溶液的家兔休息17 d后其對熱原物質的靈敏度不會降低，可繼續用于熱原檢查。所以升溫家兔休息后再利用是可行的，這有利于提高熱原檢查家兔的利用率，亦符合3R原則。

另外，從每次給藥家兔只數看，劑量越大的組，熱原檢查前基礎體溫符合規定家兔數越少，所以對休息后升溫家兔進行重新選兔后再使用很有必要。同時家兔接受低于閾劑量的細菌內毒素后，休息兩周以上時，其對細菌內毒素靈敏度升高，這對熱原檢查的影響需更進一步研究。