理氣散結浸膏對小鼠和大鼠急性毒性研究

魏譚軍，胡鳳嬌，王張，肖成，宋文杰，周殿儒，孫位軍，王毅

理氣散結浸膏，由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當歸、白芍等組成，具有理氣調血、散結止痛的功效，主治肝郁血瘀，乳腺增生，乳癖結塊，乳癰初起，乳房脹痛。此劑型為理氣散結丸的改良劑型，原劑型是達州市中西醫結合醫院臨床使用20余年的醫療機構制劑，系藥材直接打粉后制成的大蜜丸，存在服用劑量大、口感差、運輸攜帶保存不便、起效緩慢、患者依從性不好、原粉入藥微生物易超標等缺點，不僅給患者帶來不便，也限制了該藥的推廣。此次改良劑型，可以更優化的保存藥效、穩定質量、減小服用量，便于臨床應用，擴大市場規模，受眾更廣。

根據國家食品藥品監督管理局制定的《醫療機構制劑注冊管理辦法》（試行，局令第20號，2005年[4]；征求意見稿， 2015年[5]）和四川省食品藥品監督管理局制定的《四川省醫療機構制劑研究技術指南（試行版）》（2014年）[6]，理氣散結顆粒擬申請四川省醫療機構中藥制劑批文，因該處方組成含有法定標準中標識有毒性或現代毒理學證明有毒性的藥材，如山慈菇和蜂房[7]，故需開展急性毒性實驗研究，可為長期毒性試驗和主要藥效學研究中的劑量設置提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

理氣散結浸膏，生產批號為151125，由達州市中西醫結合醫院生產。按照理氣散結顆粒的最大給藥濃度和最大給藥體積分別給予小鼠和大鼠后，給藥劑量較低，不足以充分暴露其毒性，故改用理氣散結浸膏（僅未添加制備成顆粒的輔料糖粉和糊精），盡可能的以實驗可操作的最大濃度開展急性毒性實驗。

生理鹽水：規格為500 mL:4.5 g，批號為C151136，由昆明南疆制藥有限公司生產。

1.2 試驗動物

SPF級KM種小鼠和SD大鼠各40只，全雌，體重為20±2 g、200±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2015-030，《四川省實驗動物質量合格證》號：№51203500000542。

動物實驗設施、場地由成都中醫藥大學提供。

1.3 試劑

血常規試劑：溶血劑（批號1608014）、稀釋劑（批號1607022）、清洗劑（批號1608018）。

血液生化學試劑：谷丙轉氨酶（批號1612118）、谷草轉氨酶（批號1611104）、堿性磷酸酶（批號1603110）、谷氨酰轉移酶（批號1605132）、總膽紅素（批號1603111）、總蛋白（批號1611109）、白蛋白（批號1604101）、尿素氮（批號1604212）、肌酐（批號1609114）、膽固醇（批號1610110）、甘油三脂（批號1612101）、葡萄糖（批號1603114）、肌酸激酶（批號1605135）。

血常規試劑和血液生化學試劑均購自上海特康科技有限公司。

1.4 儀器

全自動生化分析儀，型號TC6010L，產自上海特康科技有限公司；全自動三分群血液分析儀，型號TEK-Ⅱ MINI，產自上海特康科技有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 預實驗 小鼠和大鼠分別按最大給藥容積40和20 mL﹒kg-1給予最大濃度2.4365 g原生藥材/mL的理氣散結浸膏溶液后，動物仍未出現死亡，故給予理氣散結浸膏原液無法測出LD50。因此，按《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》的要求，依據“動物能耐受的最大給藥容積、最大給藥濃度的藥量單次或24 h內多次（2～3次）給藥”的規定，采用最大給藥量法評價理氣散結浸膏的急性毒性[3]。

1.5.2 動物分組 將實驗小鼠和大鼠按體重分層，隨機分為空白對照組和理氣散結浸膏組，每組20只，試驗前禁食16小時，但不禁水。

1.5.3 給藥方法 經預試結果可知，理氣散結浸膏組小鼠可按照最大容積(40 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL一次性灌胃給藥，即給藥劑量為97.46 g生藥/（kg.d）；理氣散結浸膏組大鼠可按照最大容積(20 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL分兩次灌胃給藥，每次間隔4 h，即給藥劑量為48.73 g生藥/（kg﹒d）。空白對照組均給予最大容積的生理鹽水。給藥后1 h內，觀察并記錄動物是否出現中毒反應以及中毒反應的出現時間、維持時間、是否可逆及嚴重程度，分析可能的靶器官、組織或系統。后每天觀察1次，連續觀察14天。

1.5.4 觀察指標

1.5.4.1 一般狀況觀察 觀察并記錄各組每只動物有無異常，注意有無顫抖、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、少動、精神萎靡不振、昏迷等毒性反應癥狀。同時觀察中毒反應的出現時間、維持時間、是否可逆及嚴重程度，分析可能的靶器官、組織或系統。

1.5.4.2 體重和飼料消耗量 在給藥前1天、給藥當天、給藥后第7天和第14天時，觀察和記錄各組動物的體重(g)變化及進食（飼料消耗量，g/(kg﹒d)）情況。

1.5.4.3 血常規和血液生化學檢測 在給藥后第14天時，觀察未死亡動物的一般情況、天然孔道情況，然后小鼠摘眼球取血，其中每組的10只小鼠取0.5～1 mL抗凝處理，另10只小鼠取0.5～1 mL凝固后分離血清0.3～0.5 mL；大鼠以3 mL﹒kg-1腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，經腹主動脈取血，其中取0.5～1 mL抗凝處理，另取0.5～1 mL凝固后分離血清0.3～0.5 mL，檢測相應血常規和血液生化學指標。

1.6 統計學應用

運用SPSS 19.0計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±S）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況和尸檢結果

灌胃30 min～1 h內，小鼠和大鼠均出現精神萎靡、行動遲緩、鼻尖微微發紅的癥狀，但很快恢復正常，觀察期內，無動物死亡。尸檢，臟器均未出現肉眼可見病變。

2.2 體重及飼料消耗量

2.2.1 小鼠 與給藥前一天比較，給藥后第1、7、14天，各組小鼠的體重及飼料消耗量均存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；與空白對照組比較，無統計學意義（P＞0.05），詳見表1、表2。

表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

注：與給藥前1天比較，# P＜0.05，## P＜0.01;與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組（n=20） —— 23.06±1.10 23.84±1.20# 26.20±1.53## 27.88±1.55##理氣散結浸膏組（n=20） 97.46 23.40±0.86 24.37±0.90## 25.55±2.83## 27.56±1.78##

表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 —— 216.06±7.64 169.54±36.97 157.78±10.14## 157.93±8.53##理氣散結浸膏組 97.46 222.10±11.83 145.82±21.99## 177.16±23.44# 152.74±8.12##

2.2.2 大鼠 與給藥前一天比較，給藥后第1天，大鼠的飼料消耗量顯著降低（P＜0.05），給藥后第7、14天，各組大鼠體重有十分顯著地差異（P＜0.01）；與空白對照組比較，給藥后第1天，大鼠的飼料消耗量顯著降低（P＜0.05），詳見表3、表4。

表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組（n=20） —— 215.77±6.41 216.07±5.12 233.16±8.74## 246.96±8.67##理氣散結浸膏組（n=20） 48.73 212.44±5.02 213.91±5.17 228.54±9.18## 242.70±12.89##

表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

注：同上

組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 —— 74.66±9.06 72.29±6.09 83.57±4.37 77.49±4.13理氣散結浸膏組 48.73 75.93±9.92 51.76±5.53#** 83.75±3.16 74.17±2.65

2.3 血常規

2.3.1 小鼠 與空白對照組比較，理氣散結浸膏經口一次性灌胃給予小鼠后14天，動物血紅蛋白（HGB）、紅細胞比積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）和平均血小板體積（MPV）差異顯著（P＜0.05），但其變化均在正常范圍內；其余各項血常規指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表5、表6。

表5 小鼠的血常規測定結果(±S)

表5 小鼠的血常規測定結果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

血紅蛋白含量g﹒L-1指標 名稱 紅細胞數×1012/L紅細胞比積L/L平均紅細胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對照組 n=10 5.59±0.48 117.90±10.08 0.25±0.02 45.43±1.42 20.01±0.98 463.50±16.03理氣散結浸膏組 n=10 5.27±0.37 109.60±5.87* 0.23±0.02* 44.26±0.66* 19.70±0.61 468.70±14.32續表5中間細胞絕對值109/L空白對照組 n=10 18.30±0.39 60.77±33.72 350.60±121.13 7.11±0.14 6.09±1.58 3.80±0.88 0.44±0.10理氣散結浸膏組 n=10 18.47±0.38 76.68±14.83 390.10±77.86 6.95±0.10** 5.39±0.87 3.41±0.58 0.44±0.07指標 名稱 紅細胞寬度變異系數%紅細胞寬度標準差fL血小板數109/L平均血小板體積fL白細胞數109/L淋巴細胞絕對值109/L續表5血小板分布寬度%空白對照組 n=10 1.84±0.67 63.09±4.30 7.11±0.71 29.80±4.69 0.25±0.08 15.02±3.15理氣散結浸膏組 n=10 1.56±0.35 63.48±3.89 7.65±0.50 28.87±3.92 0.27±0.06 13.34±2.40指標 名稱 粒細胞絕對值109/L淋巴細胞百分比%中間細胞百分比%粒細胞百分比%血小板比積%

2.3.2 大鼠 與空白對照組比較，理氣散結浸膏經口分兩次灌胃給予大鼠后14天，各項血常規指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表6。

表6 大鼠的血常規測定結果(±S)

表6 大鼠的血常規測定結果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

血紅蛋白含量g﹒L-1指標 名稱 紅細胞數1012/L紅細胞比積L/L平均紅細胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對照組 n=20 5.04±0.28 123.65±4.28 0.24±0.01 48.03±0.86 23.25±0.90 509.55±14.08理氣散結浸膏組 n=19 5.03±0.33 124.21±4.18 0.24±0.01 48.27±1.50 23.47±1.27 511.58±22.29續表6淋巴細胞絕對值109/L空白對照組 n=20 17.75±0.35 49.62±12.10 335.45±108.00 7.34±0.10 12.44±2.09 7.98±0.96理氣散結浸膏組 n=19 17.98±0.46 50.55±13.72 322.95±130.56 7.36±0.14 11.96±2.07 7.59±1.77指標 名稱 紅細胞寬度變異系數%紅細胞寬度標準差fL血小板數109/L平均血小板體積fL白細胞數109/L續表6血小板分布寬度%空白對照組 n=20 0.86±0.15 3.52±1.42 64.94±7.65 7.02±0.54 29.55±11.06 0.25±0.08 19.07±1.51理氣散結浸膏組 n=19 0.87±0.19 3.50±1.02 63.11±7.88 7.22±0.92 29.67±8.63 0.24±0.10 19.94±2.00指標 名稱 中間細胞絕對值109/L粒細胞絕對值109/L淋巴細胞百分比%中間細胞百分比%粒細胞百分比%血小板比積L﹒L-1

2.4 血液生化學

2.4.1 小鼠 與空白對照組比較，理氣散結浸膏經口一次性灌胃給予小鼠后14天，動物血清中膽固醇（TC）含量顯著降低（P＜0.05），但其變化值在正常范圍內；其余各項血液生化學指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表7。

表7 小鼠的血液生化學指標測定結果(±S)

表7 小鼠的血液生化學指標測定結果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

甘油三酯mmol﹒L-1空白對照組 n=10 82.50±10.51 157.10±27.87 8.62±1.43 1.45±0.13 0.83±0.08理氣散結浸膏組 n=10 81.40±11.38 150.40±18.23 7.46±1.50 1.24±0.13** 0.84±0.10指標 名稱 谷丙轉氨酶u﹒L-1谷草轉氨酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1續表7葡萄糖mmol﹒L-1空白對照組 n=10 73.87±3.81 23.61±1.53 50.26±4.70 0.48±0.06 6.74±0.73理氣散結浸膏組 n=10 73.04±3.34 23.12±2.91 49.92±2.27 0.46±0.07 6.60±0.75指標 名稱 總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1球蛋白g﹒L-1白球比——

2.4.2 大鼠 與空白對照組比較，理氣散結浸膏經口分兩次灌胃給予大鼠后14天，動物血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和葡萄糖（GLU）差異顯著（P＜0.05），但變化均在正常范圍內；其余各項血液生化學指標均無顯著性差異（P＞0.05），詳見表8。

表8 大鼠的血液生化學指標測定結果(±S)

表8 大鼠的血液生化學指標測定結果(±S)

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

谷草轉氨酶u﹒L-1指標 名稱 谷丙轉氨酶u﹒L-1堿性磷酸酶u﹒L-1谷氨酰轉移酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1空白對照組 n=20 56.50±8.29 132.45±25.76 170.30±54.81 11.50±2.86 6.69±2.99 60.63±8.53 24.44±1.33理氣散結浸膏組 n=19 44.84±7.41** 149.21±22.55* 139.89±49.41 10.37±3.32 7.62±3.34 62.75±7.94 24.01±1.60續表8白球比——指標 名稱 球蛋白g﹒L-1尿素氮mmol﹒L-1肌酐umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1甘油三酯mmol﹒L-1肌酸激酶u﹒L-1葡萄糖mmol﹒L-1空白對照組 n=20 36.19±8.76 0.72±0.21 5.10±2.16 83.40±27.18 1.26±0.33 0.64±0.24 145.75±49.62 8.75±2.73理氣散結浸膏組 n=19 38.74±8.27 0.65±0.15 6.39±1.93 84.11±18.35 1.28±0.29 0.80±0.41 178.58±76.06 7.18±1.47*

3 討論

本次急性毒性實驗小鼠和大鼠經口灌胃給予理氣散結浸膏的最大劑量分別為97.46 g生藥/（kg﹒d）和48.73 g生藥/（kg﹒d），相當于成人臨床日用劑量0.3914 g生藥/（kg﹒d）的249倍和124倍，根據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》進行MTD法的測定，采用小鼠最大耐受藥量倍數計算，以耐受人臨床用量的100倍以上為安全[2]。且實驗結果表明，在此劑量下給藥后，均未見動物死亡、中毒癥狀、臟器、體重和飼料消耗量等異常變化，血常規和血液生化學指標的變化也都在正常范圍內，說明組方中山慈菇和蜂房在經過炮制加工之后，其毒性降低到了較為安全的范圍。綜上可得，理氣散結浸膏整體毒性較低，無明顯急性毒性。本結果可為長期毒性試驗和主要藥效學研究中的劑量設置提供依據。