β—羥基—β—甲基丁酸對衰老小鼠腓腸肌蛋白質合成的影響研究

尤莉蓉 趙艷 尚畫雨 孟思進 史仍飛 夏志

摘 要：探索膳食添加β-羥基-β-甲基丁酸（HMβ）對衰老小鼠骨骼肌蛋白質合成的調節作用及其作用機理。方法：16月齡雄性C57BL/6J小鼠24只隨機納入3個處理組：膳食添加HMβ組、添加等氮劑量丙氨酸組及空白對照組，其中HMβ組小鼠和丙氨酸組小鼠飼料中分別添加4.5% HMβ和3.4%丙氨酸，空白對照組則飼以國家標準維持飼料，共計干預8周。期間記錄各組小鼠體質量與采食量，測量小鼠后肢的最大抓握力。各組小鼠于末次飼食后禁食12 h，麻醉后摘眼球采血處死，移除腓腸肌外側頭淺層白肌并稱重。測定骨骼肌蛋白質總量、肌原纖維與肌漿蛋白含量且免疫印跡檢測MHCⅡ、mTORSer2448、p70s6kThr389和4EBP1Thr37/46磷酸化表達的組間差異。結果：膳食添加4.5%劑量的HMβ未顯著影響衰老小鼠體重與采食量，但可見腓腸白肌濕重、濕重/體重校正比值增加，且增幅具有統計學意義；腓腸白肌蛋白質總量、肌原纖維與肌漿蛋白質含量及MHCⅡ總量表達均顯著增長；mTORSer2448、p70s6kThr389與4EBP1Thr37/46磷酸化水平亦有明顯上調。結論：膳食添加4.5%比例HMβ具有促進骨骼肌蛋白質合成，削弱衰老性骨骼肌萎縮與功能衰退的重要潛力，其作用機理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信號轉導通路的活化。

關鍵詞：β-羥基-β-甲基丁酸；肌少癥；蛋白質合成；功能衰退；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

中圖分類號：G 804.7 學科代碼：040302 文獻標識碼：A

Abstract：Objective： To investigate the effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate （HMβ） supplementation on protein synthesis in aged mice and preliminarily explore the possible mechanism of action. Method： Twenty four C57BL/6J male mouse， 16-month old， were randomly allocated to three groups： HMβ supplementation， isonitrogenous alanine supplementation and blank control group. Mice in HMβ and alanine group were treated with standard chow diet supplemented with 4.5% HMβ and 3.4% alanine respectively for 8 weeks， while blank control group were fed with normal diet. Both body weight and food intake were recorded during research， the maximal grip strength of lateral limb was also determined. Twelve hours of fasting after the last feeding， mice exposed to anesthesia and then sacrificed via drawing blood. The white gastrocnemius muscle was removed and weighed. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content in white gastrocnemius were determined， and the phosphorylation of mTORSer2448， p70s6kThr389and 4EBP1Thr37/46 was also measured using western blotting. Results： Both body weight and food intake of aged mice were not significantly influenced by dietary HMβ supplementation. The wet weight of white gastrocnemius， and re-adjusted ratio of white gastrocnemius to body weight were significantly improved. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content， and expression of MHCⅡ were greatly increased. Furthermore， the phosphorylation rate of mTORSer2448，p70s6kThr389 and 4EBP1Thr37/46 were also found to be elevated significantly. Conclusion： Dietary HMβ supplementation with 4.5% dosage was capable of promoting muscular protein synthesis， and thus it has the potential to attenuate age-related skeletal muscle atrophy and functional decline. In terms of the possible mechanism， the mTOR/p70s6k/4EBP1 signaling pathway may be directly or at least to some extent involved in this process.

Keywords：HMβ；sarcopenia； protein synthesis； functional decline； mTOR

肌少癥（sarcopenia，SP）是一種隨年齡增長而出現的骨骼肌病理性變化，主要表現為骨骼肌量的進行性減少與功能衰退，在老齡人群中其發生率可超過30%[1]。SP過程中快縮型骨骼肌萎縮性變化明顯，患者生活質量與身心健康多受到嚴重影響，可能因此而出現摔倒、殘疾等意外傷害甚至導致死亡，是老齡人群所面臨的重要威脅之一。隨著我國社會老齡化進程的不斷發展，老齡人口日益增長，SP的發生、發展與患者醫療費用的增長直接相關，目前SP已成為影響健康老齡化的重大社會問題，對我國公共醫療開支與社會經濟也形成了較為沉重的負擔[2]；因此，加強對SP干預措施的研究，制訂合理且有針對性的干預方案，對于改善老齡人群骨骼肌功能狀態，促進健康老齡化目標的順利實現具有重要意義。

蛋白質代謝平衡的紊亂是誘發骨骼肌萎縮的根本原因[3]，就SP而言則主要因蛋白質合成的減少所致[4]。亮氨酸被認為是骨骼肌蛋白質合成的有力營養刺激，已有此前的相關研究也證實以5%比例進行膳食亮氨酸添加可有效促進老齡小鼠骨骼肌蛋白質合成，抑制衰老所致骨骼肌萎縮[5-7]；但近期有個別研究認為，亮氨酸代謝中間產物β-羥基-β-甲基丁酸（β-hydroxy-β-methylbutyrate，HMβ）可能更適于作為干預SP的營養手段。其原因有二：一方面，HMβ與亮氨酸相比能以更低的劑量產生更顯著的促蛋白質正性平衡作用[8]；另一方面，以高劑量進行亮氨酸補充可能促進腫瘤生長，從而限制了其在惡性腫瘤高危老年人群中的應用[9]。就HMβ而言，目前學界多認為其對骨骼肌蛋白質代謝的調節作用主要集中于削弱降解方面的潛力；因此，對于惡病質與長期臥床等消耗狀態下的骨骼肌萎縮可能具有較好的干預效果，但其究竟能否通過促進衰老骨骼肌蛋白質合成而發揮保護作用，迄今仍無定論。鑒于此，本研究擬在前期關于亮氨酸的研究基礎上，觀察膳食添加等氮劑量HMβ對衰老小鼠快縮型骨骼肌蛋白質合成與肌力的影響，評價其在預防衰老性骨骼肌萎縮和功能衰退方面的潛力，并通過觀察調節蛋白質合成的關鍵信號通路的表達變化，初步探討HMβ可能的作用原理。

1 研究方法

1.1 實驗法

1）實驗對象及分組。16月齡C57BL/6J雄性小鼠24只，體質量（48.6±0.9） g，由南京鵬晟生物有限公司提供。單籠飼養，自由攝食、飲水，室溫（22±1.5） ℃，光照12 h。區間分組法據體質量隨機納入空白對照組（N）、膳食添加丙氨酸對照組（A）與膳食添加HMβ組（H），每組8只。

2）飼料配制。已有研究表明，5%亮氨酸可有效促進骨骼肌蛋白質正性平衡，對于衰老骨骼肌具有積極的保護作用[5-7]。本研究中采用與5%亮氨酸等氮劑量的HMβ（純度95%）來添加。具體方法為：以普通國標維持飼料為底料，沿襲替換等量玉米粉的方法，在H組小鼠飼料內添加4.5%比例HMβ，A組小鼠飼料中仍添加3.4%非必需氨基酸丙氨酸，配為等氮對照飼料，以使各組飼料的粗蛋白基本一致。H組飼料的消化能、粗蛋白、鈣、總磷與有效磷含量分別為14.57 MJ/kg、24.3%（質量比）、1.26%（質量比）、1.15%（質量比）與0.91%（質量比），氨基酸檢測如圖1所示。各組實驗動物飼料的氨基酸含量見表1。

3）實驗方案。參考已有研究方法[5-7]，N組小鼠飼喂底料，H組飼喂HMβ添加料，A組飼喂添加丙氨酸的等氮飼料，每周稱量3次并記錄采食量，干預8周后處死取材。

4）主要儀器與試劑。主要儀器：美國Thermo MultiSkan3型酶標儀、美國Bio-Rad電泳儀、北京凱元Mini P-4電泳槽、濟南益延科技YLS-13A大小鼠抓握力計。主要試劑：常規試劑均購自國家標準物質中心或國藥集團化學試劑公司。食品級HMβ購自靖江市三益化工有限公司，丙氨酸購自上海生工公司（AD0022）。蛋白提取試劑與蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司（78510、23235或23200），蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司（11836153001），mTOR總量與Ser2448位點磷酸化一抗（5536S、2983S）、p70s6k總量與Thr389位點磷酸化一抗（2708S、9234S）、4EBP1總量與Thr37/46位點磷酸化一抗（2855S、9644S）購自北京賽信通公司，Ⅱ肌球蛋白重鏈（MHCⅡ）總量抗體一抗（Ab51263）購自上海艾博抗公司，HRP標記二抗購自美國Jackson公司（115-035-003、111-035-003），蛋白Marker購自立陶宛Fermentas公司（SM6210）。

5）取材。各組小鼠在取材前禁食過夜，飲水不限。取材日0.3 mL/（100 g ）劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后摘眼球采血。常規分離血清與血漿后分裝保存待測。快速分離腓腸肌外側頭白肌，液氮速凍后置超低溫冰箱保存待測。

6） 測試方法。

①肌原纖維與肌漿蛋白定量。肌原纖維與肌漿蛋白含量測定參考Koopman等[10]的研究，肌樣在5%預冷緩沖液（0.25 mol/L蔗糖、2 mmol/L EDTA與10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl）中勻漿后600g離心20 min，收集含肌原纖維蛋白的沉降物，上清于4 ℃ 100 000g離心60 min分離肌漿蛋白。采用Bradford法進行蛋白定量：吸取0、0.01、0.02、0.04和0.05 mL 1 mg/mL BSA于比色管內，加入0.1、0.09、0.08、0.06、0.04、0.02和0 mL生理鹽水后加入5 mL考馬斯亮藍，混勻靜置20 min，595 nm波長測定OD值。循此法取0.01 mL蛋白樣本與0.09 mL生理鹽水及等量考馬斯亮藍混勻靜置后測定OD值。據OD值計算蛋白含量。

②蛋白表達分析。Western blotting測定蛋白表達，方法同已有研究[5-7]：肌樣加入蛋白提取試劑后剪成1～2 mm3碎粒并勻漿，4 ℃ 10 000g離心20 min后取上清。蛋白定量后以每次上樣120 μg的標準分裝，PBS補足20 μL。加入5X上樣緩沖液5 μL后煮沸變性。配制5%濃縮膠與15%分離膠，濃縮膠80 V恒壓30～40 min，分離膠120 V恒壓，溴酚藍至板底后停止。濕轉法轉膜，恒流300 mA，MHCⅡ表達的轉膜2.5 h，稀釋比1∶3 000；mTOR表達轉膜2 h，稀釋比均為1∶1 000；p70s6k表達轉膜1 h，總量與磷酸化表達稀釋比分別為1∶2 000與1∶500；4EBP1表達轉膜0.5 h，稀釋比均為1∶1 000。

③肌肉功能評價。采用小鼠后肢抓握力評價骨骼肌功能。根據已有的經驗，16月齡小鼠每周肌力變化并不顯著，因此，本研究中在正式干預前測定基礎值，此后每2周重復測量一次。測試時用靜脈輸液管套住小鼠前爪使其不能抓握，提起鼠尾使其后肢抓緊測力板金屬抓握桿，緩慢水平向后拉動，雙側后肢若同時松開則記錄顯示器數值。每只小鼠視測試表現重復6～10次，以最大值為準。

1.2 數理統計法

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。體質量與平均采食量指標采用Repeated measures ANOVA進行統計分析，不滿足球對稱時，參照Greenhouse-Geisse校正結果。對各組動物組內各時點值進行多重比較時，若校正系數Epsilon<0.7時采用Bonferroni法進行置信區間校正。其他指標均采用One-way ANOVA進行統計分析，組間多重比較也參照Bonferroni校正的結果。P≤0.05時，認為差異具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 體質量

實驗期內小鼠體質量變化如圖2所示。重復測量方差分析結果顯示：球形檢驗P<0.01，不滿足球對稱，需采用校正后結果進行判斷。其中時間因素的主效應顯著（F=15.736，P<0.01），提示各組小鼠體質量在實驗周期內均具有隨時間而變化的趨勢；組內各時點間多重比較的Bonferroni校正結果表明N組與H組小鼠各時點體質量未見顯著差異，僅N組小鼠第4、7、8周體質量較第2周有顯著升高，P值分別為0.038、0.021、0.029。分組因素（F=2.076，P=0.151）與交互效應（time×group，F=0.962，P=0.453）均未具統計學意義，提示不同處理未導致各組小鼠體質量產生具有統計學意義的差異，各時點組間多重比較結果亦未見顯著差異。

2.2 采食量

實驗期內小鼠采食量變化如圖3所示。重復測量方差分析結果顯示：球形檢驗P=0.032，采用校正后結果判斷。時間（F=0.1761，P=0.130）、分組（F=0.794，P=0.465）因素的主效應及兩因素的交互效應（F=0.399，P=0.966）均未見統計學意義，提示各組小鼠平均采食量在整個實驗周期內未見顯著變化，不同處理也未對其采食量造成明顯影響。組內各時間點多重比較與組間各時點采食量多重比較結果也未見具有統計學意義的差異。

2.3 處死前體質量與腓腸白肌重

如圖4A所示，單因素方差分析結果顯示各組小鼠處死前體質量組間差異未見統計學意義（F=1.428，P=0.262）。如圖4B所示，腓腸白肌濕重組間差異具有統計學意義（F=3.332，P=0.050），組間多重比較結果也表明H組（157.8±10.4）小鼠腓腸白肌濕重顯著高于N組（149.0±8.4）與A組（147.9±5.6），P值分別為0.049與0.028。腓腸白肌濕重與體質量比值如圖4C所示，方差分析結果表明組間差異具有統計學意義（F=4.354，P=0.026），多重比較結果也顯示H組（0.33±0.019）比值顯著高于N組（0.30±0.023）與A組（0.31±0.016），P值分別為0.010與0.047。

2.4 骨骼肌蛋白質總量、肌原纖維與肌漿蛋白質含量

如圖5A所示，腓腸白肌蛋白總量組間差異具有統計學意義（F=7.206，P=0.004），組間多重比較結果也表明H組（43.3±2.2）小鼠蛋白總量顯著高于N組（38.5±3.7）與A組（39.0±2.2），P值分別為0.007與0.017。如圖5B所示，肌原纖維蛋白含量組間差異具有統計學意義（F=19.655，P=0.000），組間多重比較結果也表明H組（39.8±1.4）小鼠蛋白總量顯著高于N組（32.8±2.5）與A組（32.1±3.8），P值均為0.000。肌漿蛋白含量如圖5C所示，H組（35.3±2.8）含量顯著高于N組（30.1±2.2）與A組（30.5±1.4），P值均為0.001。

2.5 肌力

實驗期內小鼠抓握力變化如圖6所示。重復測量方差分析結果顯示：球形檢驗P=0.000，采用校正后結果判斷。除分組因素之外（F=0.128，P=0.880），時間（F=23.347，P=0.000）因素的主效應及兩因素的交互效應（F=65.545，P=0.000）均具有統計學意義，提示各組小鼠的抓握力量在整個實驗周期內具有顯著變化，但不同處理也未導致顯著的組間差異。然而，對不同時點各組間組小鼠抓握力進行比較發現，第8周時H組小鼠肌力（126.6±14.4）與N組（115.4±13.9）與A組（116.7±10.6）的差異接近臨界P值，分別為0.054與0.062。對各組小鼠不同時點抓握力的縱向比較發現，較初始值而言，N組（P=0.018，P=0.000）與A組（P=0.012，P=0.000）小鼠第6、8周肌力顯著降低，而H組則表現為增強（P=0.036，P=0.003）。

2.6 促蛋白質合成信號通路蛋白表達

如圖7A所示，H組（1.94±0.27）小鼠mTORSer2448磷酸化率較N組與A組上調，P值均為0.001，差異具有統計學意義；如圖7B所示，H組（2.20±0.44）p70s6kThr389磷酸化率同樣較N組與A組小鼠上調，P值均為0.002，差異也具有統計學意義；如圖7C所示，H組（2.01±0.37）4EBP1Thr37/46磷酸化水平較2個對照組升高，具有統計學意義（P=0.002）；就MHCⅡ（2.46±0.25）蛋白表達而言，H組亦較N組與A組增高，增幅具有統計學意義（P=0.000）。

3 討論

本研究在前期關于亮氨酸干預效果的研究基礎上[5-7]，使用小鼠國標維持飼料為底料，采用等量替換玉米粉的形式，以與5%亮氨酸等氮（粗蛋白）的劑量進行了HMβ添加，劑量經等氮換算為4.5%。就對照組而言，循常規設立了等氮對照組與空白對照組，其中等氮組同樣采用了3.4%比例的α-丙氨酸添加。α-丙氨酸作為一種可以快速代謝的非必需氨基酸，已被證實不影響骨骼肌蛋白質合成，常作為氨基酸營養研究中的等氮處理手段[6]。通過本研究的實驗組飼料氨基酸檢測結果可見，飼料配制是完全滿足本研究需要的。而關于研究期內體質量與平均每日采食量的變化結果也表明，以4.5%劑量添加HMβ并未顯著改變小鼠正常生長性能與平均采食量，進一步佐證了以國標維持料作為底料進行的HMβ或丙氨酸添加的可取性。

衰老骨骼肌蛋白質合成水平的變化是本研究所關注的科學問題。本研究通過骨骼肌濕質量、骨骼肌濕質量/終末體質量百分比，骨骼肌蛋白質總量、肌原纖維蛋白質含量、肌漿蛋白質含量，以及骨骼肌蛋白質合成關鍵信號通路蛋白功能表達水平3個方面的適應性變化建立評價指標體系，分別從組織、分子和蛋白質3個層面對不同處理手段對衰老骨骼肌蛋白質合成代謝所造成的影響進行了探討。就組織重量的變化而言，添加HMβ導致腓腸白肌濕重較對照組呈增加趨勢，且增幅具有統計學意義。由于同月齡小鼠的骨骼肌量可能受到體質量的直接影響，因此，采用各組小鼠處死前體質量對腓腸白肌濕重進行了校正，結果也觀察到了具有統計學意義的組間差異。提示HMβ組小鼠腓腸白肌較進行等氮干預的丙氨酸組和空白對照組小鼠出現了適應性肥大，與前人的相關研究結果一致。Gerlinger-Romero等[11]最近的一項動物實驗表明，給成年大鼠以320 mg/kg劑量強飼HMβ共計28 d，可致趾長伸肌濕重較安慰劑對照大鼠出現顯著增長。而Vukovich等[12 ] 早期采用老年人體被試所進行的研究也觀察到，膳食添加HMβ的被試較對照組在第8周時呈現出顯著的瘦體質量增長。

由于小鼠骨骼肌量較小，而本研究中所使用的腓腸白肌僅為腓腸肌外側頭淺層白色部分；因此，在取材時難以避免的誤差可能會對本研究結果造成混雜影響。基于此進而檢測了不同處理組中骨骼肌蛋白質含量的差異。作為蛋白質合成水平的直接評價指標，骨骼肌蛋白質總量、肌原纖維蛋白質含量及肌漿蛋白質含量可以更為直觀、準確地揭示蛋白質合成的變化趨勢。數據表明：無論是蛋白質總量還是肌原纖維或肌漿蛋白質含量，均表現出了顯著的組間差異，且添加HMβ組小鼠的蛋白質水平較對照組高。在目前的參考文獻中，Flummer等[13]給仔豬飼料中添加HMβ[15 mg Ca（HMβ）2/kg]28 d發現，實驗組仔豬的蛋白質含量顯著高于安慰劑對照動物，也與本研究所觀察到的結果一致。骨骼肌是機體最為重要的蛋白質存儲池，不僅有50%～75%的機體蛋白質儲備于骨骼肌內，且這一儲備直接受到骨骼肌蛋白質合成與降解平衡的動態調節；因此，保持這一平衡對于預防萎縮、維護代謝健康至關重要[14]。如前所述，SP發生與發展的重要特點及根本原因在于蛋白質合成量的減少，因此，腓腸肌蛋白質總量與肌原纖維、肌漿蛋白含量的增多提示膳食添加HMβ可能具有改善SP的重要潛力。

調節骨骼肌蛋白質合成的信號轉導通路不僅是探討各種干預手段作用機制的重要靶點，同時也可作為蛋白質代謝水平的間接指示，通路中關鍵調控蛋白的功能表達變化同樣能夠反映蛋白質合成的上調或下調趨勢。前期的研究表明，衰老骨骼肌蛋白質合成的調節機制也以mTOR為中心，合成代謝刺激可通過mTOR介導直接控制翻譯的起始與延伸；因此，在蛋白質合成調節方面發揮重要作用[5-7]。此前也有研究證實，特異性阻斷mTOR的功能表達將抑制95%的適應性肌肉肥大[15]。mTOR下游靶蛋白在蛋白質合成調節過程中也具有重要作用，其中p70s6k可磷酸化rPS6并進而控制含有5-末端寡聚嘧啶的mRNAs的翻譯效率。4EBP1的磷酸化則調節eIF4F復合物的裝配，對于帽依賴性翻譯的起始具有重要作用；因此，就衰老骨骼肌蛋白質代謝而言，mTOR/p70s6k/4EBP1信號轉導通路的活化也被視為蛋白質合成增加的間接表現。本研究中觀察到，膳食添加HMβ組小鼠mTORSer2448、p70s6kThr389與4EBP1Thr37/46的蛋白質磷酸化率較等氮與空白對照組小鼠均有顯著上調，提示該組小鼠腓腸白肌蛋白質合成增加，且表明該通路在HMβ調節衰老骨骼肌蛋白質合成過程中也具有重要作用。Eley等[16]對C2C12肌管細胞給予50 mM HMβ孵育，發現顯著刺激了細胞蛋白質合成，這一反應與mTOR及其下游靶蛋白4EBP1與p70s6k的磷酸化呈正性相關，且可以為mTOR抑制劑雷帕霉素所阻斷，這一結果較好地佐證了mTOR/p70s6k/4EBP1信號轉導通路在調節骨骼肌蛋白質合成中的貢獻。但是，HMβ究竟通過何種途徑調節這一信號通路？迄今仍不清楚。就MHCⅡ蛋白表達而言，由于SP主要表現為快縮型骨骼肌的變化，而快縮型骨骼肌纖維類型及收縮表型由Ⅱ型相對表達所決定；因此，MHCⅡ的表達變化也對骨骼肌蛋白質合成水平有間接指示作用。本研究中補充HMβ導致小鼠腓腸白肌內MHCII的表達顯著上調，進一步反映了蛋白質合成反應的增強。

除上述骨骼肌蛋白質合成評價指標體系之外，肌肉力量的增長可在一定程度上反映機體同化作用的增強。就HMβ對肌力的影響而言，本研究觀察到膳食添加HMβ使小鼠抓握力從第4周開始呈上升趨勢，至第6周時即已表現出顯著的增長，而等氮與空白對照組小鼠肌力則呈相反變化趨勢，在第6周時較實驗前有明顯下降。盡管實驗末次測試的小鼠最大抓握力仍未見顯著組間差異，但組內縱向比較的結果仍然足以說明HMβ對衰老骨骼肌肌力的保護作用。前人探討HMβ促力作用時，肌力變化多作為一項重點關注指標。Payne等[17]以杜氏肌肉營養不良模型小鼠為研究對象，發現補充8周HMβ可增強小鼠抓握力并延長抓握耐力，且肌肉丟失得到緩解。Noh等[18]給經地塞米松處理的大鼠以150或600 mg/kg劑量灌胃HMβ 5 d，發現肌肉丟失與握力下降均受到抑制。Park等[19]以0.5 g/kg劑量給接受能量限制（-30%）的小鼠施加HMβ干預6周，也觀察到抓握力與腓腸肌量的增長。可見，HMβ在多種肌肉萎縮條件下均可對肌肉質量和肌肉力量產生保護作用。而Vallejo等[20]近期以19月齡小鼠為研究對象，以514 mg/kg劑量補充HMβ 8周，同樣發現肌肉功能衰退受到明顯抑制，進一步佐證了HMβ在改善SP小鼠肌力方面的作用潛力。

就HMβ通過刺激骨骼肌蛋白質合成改善骨骼肌萎縮與功能衰退的作用而言，相關研究結果目前仍有分歧[21]。作為亮氨酸的中間代謝產物，HMβ經亮氨酸代謝生成比例僅為5%左右，既然亮氨酸的營養促力作用已達成共識，則關于HMβ研究結果的矛盾從理論上而言可能仍源自于干預劑量與干預周期的差異。Rossi等[22]最近研究發現老年人群每日需攝入高達60 g亮氨酸以滿足機體對HMβ的需求量。本研究是在前期亮氨酸相關研究的基礎上采用等氮劑量進行HMβ膳食添加，而5%劑量亮氨酸被認為有助于血漿亮氨酸達到維持骨骼肌細胞內外最佳比例的水平，加之研究對象為自然衰老小鼠，8周干預周期相對較為充足，從而能夠產生積極的干預效果。從這一角度看，其應用可能仍需要臨床轉化醫學領域的深入研究。此外，基于上述線索，不難理解HMβ與亮氨酸相比為何能以較小劑量而發揮更為顯著的效果，但兩者調節衰老骨骼肌蛋白質合成作用的異同仍有待進一步比較予以明確。

4 結束語

以4.5%劑量膳食添加HMβ可促進快縮型骨骼肌蛋白質總量、肌原纖維與肌漿蛋白質含量增多，MHCⅡ蛋白表達上調，骨骼肌濕重增長及肌肉力量增加，具有促進衰老骨骼肌蛋白質合成、預防和延緩衰老性骨骼肌萎縮與功能衰退的重要潛力，其作用機理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信號轉導通路的活化。但HMβ激活該通路的具體途徑即mTOR的上游調控蛋白目前仍不清楚，其較亮氨酸在調節骨骼肌蛋白質合成方面的作用有何差異亦需明確，這些問題仍有待進一步研究。

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