乙肝患者HBV感染相關特異性miRNA篩選及其功能研究

葛文濤　　熊瑛　　王華忠

[摘要] 目的 尋找乙型肝炎病毒特異性的miRNA，并在體內驗證找到的miRNA的功能，從而為阻斷乙肝進一步發展提供新方法。 方法 利用miRNA芯片分析3對正常肝臟組織與慢性乙型肝炎組織的miRNA，尋找兩者之間差異表達的miRNA。用實時定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR，RT-PCR）在更多的組織標本中驗證差異表達，確定有意義的miRNA。在鼠病毒性肝炎模型中通過靜脈注射有意義的miRNA或anti-miRNA進行干預，同時刺激向肝癌方向轉變，觀察其病毒復制情況。 結果 與正常肝臟組織相比，慢性HBV病毒感染組織中表達上調的miRNA 有8 個，表達下調的miRNA 有16個。miR-143在肝癌組織中的表達降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌組織中的表達提高（P=0.0320）。 結論 miRNA在乙型肝炎的發生、發展中起重要作用，其功能的失調可能導致其最后發展成為肝硬化甚至肝癌，并且可以影響乙型肝炎治療效果。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；miRNA；HBV感染；篩選；功能

[中圖分類號] R512.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）17-0035-03

Screening and functional study of specific miRNA of HBV infection in hepatitis B patients

GE Wentao1 XIONG Ying2 WANG Huazhong2

1.First Department of Medicine， the People's Hospital of Wuyuan in Jiangxi Province， Wuyuan 333200， China； 2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330000， China

[Abstract] Objective To find the specific miRNA of hepatitis B virus and verify the functions of the miRNA in vivo， so as to provide a new method for blocking the further development of hepatitis B. Methods We used miRNA chips to analyze the miRNA of 3 pairs of normal liver tissues and chronic hepatitis B tissues， and found the different expression of miRNA. Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to verify the different expression in more tissue samples to identify significative miRNA. Intervention by intravenous injection of the significative miRNA or anti-miRNA in the viral hepatitismodels of rat was done. At the same time， we stimulatedthem to turn into liver cancer and then observed the replication of the virus. Results Compared with normal liver tissue， 8 miRNAs were up-regulated in chronic HBV-infected tissues， and 16 miRNAs were down-regulated. The expression of miR-143 was decreased in hepatocellular carcinoma（P=0.0029）， and the expression of miR-520d-5p in hepatocellular carcinoma was increased（P=0.032）. Conclusion miRNA plays an important role in the incidence and development of hepatitis B. The dysfunction of it may lead to the final development of liver cirrhosis and even liver cancer， and it can affect the therapeutic effect of hepatitis B.

[Key words] Hepatitis B virus； miRNA； HBV infection； Screening； Function

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種小的雙鏈DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，是已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒。HBV感染已經成為一個全球性問題。到2010年，已報道2.48億人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性，并且盡管存在有效的疫苗，病毒導致每年約780 000例死亡，據估計，約15%～30% HBV攜帶者有發展為肝硬化的風險[1]。

微小RNA是一個長約23nt的非蛋白編碼小分子單鏈RNA，是進化中保守的內源性核酸，通過RNA的作用機制與靶基因的3UTR結合，在轉錄后調節基因的表達，即調控翻譯或對靶蛋白直接剪接。miRNA參與所有生物過程中復雜調節網絡和控制基因表達，包括細胞發育、免疫反應、衰老和細胞死亡。到目前為止，已有1881種前體及2588個成熟人miRNA注冊（miRbase version 21.0）[2]。本實驗通過篩選乙型肝炎病毒特異性的miRNA，并在大鼠體內驗證，從而了解miRNA的功能。

1 材料與方法

1.1 材料來源

隨機選取2011年9月～2012年3月至我院消化內科行肝組織活檢的慢性HBV病毒感染和正常肝臟標本各27例。慢性HBV病毒感染診斷依據2015年中華醫學會肝病學分會發布的《慢性乙型肝炎防治指南》[3]：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是指HBsAg 和（或）HBV-DNA 陽性6個月以上。正常肝臟組織是指：既往及住院過程中檢查無肝臟疾病。慢性HBV病毒感染組患者的平均年齡（39.4±6.5）歲（年齡范圍28～52歲），其中男17例，女10例，正常肝臟組織組患者平均年齡（40.9±6.9）歲（年齡范圍27～61歲），其中男21例，女6例，所有組織標本離體后立即放入液氮冷藏， 后轉入-80℃保存。

動物選取：在南昌大學醫學院動物實驗中心挑選攜帶拷貝HBV全基因組序列成年Tg小鼠共88只，體重17～25 g，清潔級別Ⅱ級，雌雄各44只，每只小鼠均無缺陷，且發育良好。

1.2 方法

1.2.1 提取組織中總RNA 選取3對年齡在30～40歲男性的慢性HBV病毒感染和正常肝臟組織，運用TRIzol試劑（Invitrogen life technologies）將3對組織中的總RNA逐步提取出來，在此過程中嚴格依據說明書步驟。測其A260值和A280值，A260/A280比值檢測純度，在此過程中充分利用紫外分光光度計。

1.2.2 miRNA芯片分析兩組組織miRNA表達差異 分別取5 μg從兩組3例肝臟組織中提取的總RNA，用Affymetrix購買的miRNA 基因表達譜芯片Gene Chip miRNA（4.0版）進行分析。對各個芯片的每個探針數據進行標準化處理（即原始值與背景值的差值，中值做標準化），計算出差異表達的miRNA。

1.2.3 差異性miRNA反轉錄 按照TAKARA逆轉錄試劑盒說明書逐步加入試劑，用差異性miRNA特異性引物合成cDNA，總反應體系為20 μL。

1.2.4 用RT-PCR定量分析成熟的miRNA，確定有意義的miRNA 成熟miRNA表達用U6基因做標準化，用2-ΔΔCT方法計算miRNA表達水平。

1.3 觀察指標

詳細記錄miRNA基因芯片3對慢性HBV病毒感染和正常肝臟組織中miRNA表達情況，同時，用RT-PCR在擴大樣本中驗證以上有差異表達的miRNA。此外，對miR-143和miR-520d-5p在肝癌和正常肝組織中的表達情況進行觀察。

1.4 統計學分析

使用SPSS 17. 0統計學軟件，計量資料采用t檢驗，檢驗水準α=0.05，最終確定差異miRNA。

2 結果

2.1 miRNA基因芯片分析3對慢性HBV病毒感染和正常肝臟組織中miRNA表達情況

提取3對慢性HBV病毒感染和正常肝臟組織中的總RNA，紫外分光光度計測 A260/A280比值為2.2，提取的RNA樣品純度可用GeneChip miRNA芯片篩選差異表達的miRNA，以2 倍差異變化有意義標準，與正常肝臟組織相比，慢性HBV病毒感染組織中表達上調的miRNA 有8 個，表達下調的miRNA 有16個（表1）。

2.2 miR-143和miR-520d-5p在肝癌和正常肝組織中的表達情況

用RT-PCR在樣本中驗證以上miRNA表達情況，如miR-143和miR-520d-5p在肝癌組織平均表達水平分別是5.04×10-2（范圍1.47×10-3～2.9×10-1）和5.69×10-6（范圍2.14×10-8～3.15×10-5）。在配對的正常肝組織中，miR-143和miR-520d-5p表達水平分別是1.24×10-1（范圍5.37×10-3～7.86×10-1）、3.49×10-6（范圍2.43×10-8～ -3.34×10-5），證明miR-520d-5p在慢性HBV病毒感染組中表達上調，miR-143在慢性HBV病毒感染組中表達下調，差異有統計學意義。miR-143在肝癌組織中的表達降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌組織中的表達提高（P=0.0320）。

3 討論

miRNA屬于一類成熟狀態下非編碼單鏈小RNA，只有約23nt，在從線蟲、動物、人類等多種生物中廣泛存在，由于其一方面在個體生長發育中發揮著極為重要的作用，另一方面在細胞增殖凋亡、炎癥及腫瘤等中發揮著極為重要的作用，因此得到了臨床充分重視[4]。第一個miRNA（lin-4）由Duetal在線蟲中發現[5]，近年來，共有約9539個miRNA從103個左右的物種中被發現，其中約706個從人類中被發現[數據來源于http：//miRNA.sanger.ac.uk/sequences/（Sanger miRBase 13.0）]，據估計，這些miRNA可能對人類30%及以上的基因進行調控[6]。大量相關醫學研究表明[7-10]，多種人類腫瘤均具有異常的miRNA表達，如胰腺癌中miR-221表達上調、肺癌中的let-7表達下調等，說明在腫瘤的發生發展中，miRNA可能將類似抑癌基因或癌基因的作用發揮出來。正常情況下，成熟的miRNA參與正常細胞穩態的維持，途徑為對靶基因miRNA的穩定性或翻譯進行調控，因此如果miRNA表達異常，則其相應靶基因轉錄后就可能具有異常的表達水平[11-15]。

本研究通過適時定量PCR檢測及miRNA芯片檢測發現，一些miRNA在HBV相關性肝癌及乙型肝炎肝硬化組織中比正常人類肝臟組織具有顯著較高的表達，說明在HBV感染-肝硬化-肝癌的發生發展過程中，這些差異性表達于不同類型肝臟組織中的miRNA可能發揮著類似抑癌或癌基因的作用。用GeneChip miRNA芯片篩選差異表達的miRNA，以2 倍差異變化有意義標準，與正常肝臟組織相比，慢性HBV病毒感染組織中表達上調的miRNA 有8個，表達下調的miRNA 有16個。慢性HBV病毒感染和正常肝臟組患者的年齡及性別均無統計學差異，用RT-PCR在樣本中驗證以上miRNA表達情況，如miRNA143和miR-520在肝癌組織平均表達水平分別是5.04×10-2（范圍1.47×10-3～2.9×10-1）和5.69×10-6（范圍2.14×10-8～3.15×10-5）。在配對的正常肝組織中，miRNA143和miR-520表達水平分別是1.24×10-1（范圍5.37×10-3～7.86×10-1）、3.49×10-6（范圍2.43×10-8～-3.34×10-5），證明miRNA-520在慢性HBV病毒感染組中表達上調，miRNA-143在慢性HBV病毒感染組中表達下調，差異有統計學意義。miR-143在肝癌組織中的表達降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌組織中的表達提高（P=0.0320）。

綜上，HBV感染-肝硬化-肝癌進程中，miRNA表達的改變可能是始動因素，相關miRNA表達的改變可能為該進程的發生發展提供了良好的前提條件。

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（收稿日期：2017-11-21）