同型半胱氨酸和乳腺癌相關基因在乳腺癌診斷中的應用*

李 強，鄧 君（.成都航天醫院檢驗科，四川成都60000；2.四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都60000）

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，對其易感基因的研究越來越受到人們重視，目前發現了多種基因表達異常與乳腺癌的發生、發展和預后有關，如人乳房珠蛋白（hMAM）基因[1]、myc基因[2]、HER?2 基因[3]和乳腺癌易感基因?1（BRCA?1）[4]等。近年來，有文獻報道，同型半胱氨酸（Hcy）與乳腺癌的發生、發展有一定的相關性，是晚期乳腺癌獨立危險因子[5?7]。但Hcy與乳腺癌相關基因聯合檢測在診斷中的應用研究尚少見。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應（FQ?PCR）法，檢測乳腺癌患者外周血中hMAM、BRCA?1和myc基因表達量，同時采用循環酶法檢測Hcy水平，探討聯合檢測對乳腺癌診斷應用價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年6月成都航天醫院門診和住院乳腺疾病患者165例，按疾病嚴重程度分為良性乳腺病組（58例）和乳腺癌組（107例）。良性乳腺病組：年齡18～67歲；脂肪瘤27例，纖維瘤31例。乳腺癌組：年齡25～79歲；浸潤性導管癌40例，乳腺單純癌38例，不典型髓樣癌8例，黏液癌21例；臨床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期13例。所有患者經明確病理學診斷確診。同時選取健康體檢女性40例作為對照組，年齡20～71歲。3組年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.1.2 試劑和儀器 Hcy檢測采用奧林巴斯680全自動生化分析儀，FQ?PCR Light Cycle熒光實時定量PCR儀購自瑞士Roche公司，FQ?PCR、反轉錄和內對照試劑盒均購自邁克生物技術有限公司。在7700序列檢測分析儀上測定標準品和hMAM、myc和BRCA?1和GAPDH含量。引物和探針由華美生物工程公司合成。

1.2 方法 取靜脈晨血5 mL，1 mg/mL乙二胺四乙酸抗凝，采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。利用Trizol液提取總RNA，進行凝膠電泳鑒定。采用AMV反轉錄酶體系對提取的總RNA進行RT?PCR，42℃55 min。FQ?PCR 引物各 400 nmol/L，cDNA 5 μL，TaqDNA聚合酶 1.25 U，探針 150 nmol/L，10×緩沖液 5 μL，脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸和脫氧胞嘧啶核苷三磷酸各 200 μmol/L，尿嘧啶脫氧核苷三磷酸 400 μmol/L，二氯化鎂5 mmol/L，尿嘧啶N?糖基化酶0.5 U。反應條件：50℃ 120 s，95℃10 min；再 94℃ 30 s，66 ℃ 60 s，42個循環。應用2?ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量，健康人組基因相對表達量為 1.011±0.083，以 2?ΔΔCt＞2 判斷為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件對數據進行處理。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA?1和myc基因檢測結果比較 良性乳腺病組Hcy水平和hMAM、BRCA?1、myc基因表達與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；乳腺癌組BRCA?1基因表達顯著低于對照組和良性乳腺病組，而Hcy水平和hMAM、myc基因表達均顯著高于對照組和良性乳腺病組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因檢測結果比較（±s）

表1 3組Hcy水平和hMAM、BRCA-1、myc基因檢測結果比較（±s）

注：與對照組比較，aP＞0.05；與乳腺癌組比較，bP＜0.05

組別對照組良性乳腺病組乳腺癌組Hcy（μmol/L）9.22±2.54b 10.17±2.73ab 23.21±8.65 BRCA-1（×10-3）0.97±0.11b 0.94±0.15ab 0.35±0.04 myc（×10-3）1.45±0.13b 1.39±0.09ab 3.97±0.51 hMAM（×10-3）2.05±0.19b 1.95±0.06ab 6.88±0.74

2.2 Hcy和hMAM、BRCA?1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結果比較 在乳腺癌組中，Ⅲ+Ⅳ期患者Hcy水平和hMAM、myc基因表達均顯著高于Ⅰ+Ⅱ期，而BRCA?1基因表達顯著低于Ⅰ+Ⅱ期，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結果（±s）

表2 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因在乳腺癌臨床分期中的檢測結果（±s）

n分期I+II期Ⅲ+Ⅳ期6542 myc（×10-3）2.81±0.455.32±0.87 hMAM（×10-3）4.72±0.637.91±1.02 BRCA-1（×10-3）0.45±0.070.23±0.01 Hcy（μmol/L）19.36±5.0228.36±11.26

2.3 Hcy和 hMAM、BRCA?1、myc基因對乳腺癌診斷性能 Hcy和hMAM、BRCA?1、myc基因聯合檢測乳腺癌的靈敏度和陰性預測值均顯著高于單個指標，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 Hcy和hMAM、BRCA-1、myc基因對乳腺癌診斷性能

3 討 論

BRCA?1、hMAM和myc均是近年來研究得較多的乳腺癌相關基因，其中BRCA?1是抑癌基因，也是乳腺癌最強易感基因之一，其變異攜帶者乳腺癌發病率高達60%～80%，歐美國家已將其列為遺傳高風險人群篩查項目。BRCA?1在細胞生長、凋亡中起著關鍵作用，參與DNA損傷修復，當發生突變時，基因組穩定性遭到破壞，蛋白質表達功能下降，導致細胞惡變和增殖[8?9]。myc基因屬于核蛋白類調控基因，編碼細胞增殖、分化和凋亡等轉錄因子，在乳腺癌的擴增率約占30%，其異常表達與腫瘤發生、分期和遠處轉移等有關[10?11]，可輔助預測腫瘤復發和生存期。hMAM是1996年WATSON等發現并證實只在乳腺組織中表達的乳腺癌相關蛋白，具有極高組織特異性，其異常表達與乳腺癌的微轉移和療效密切相關[12?13]。

Hcy屬于含硫氨基酸，高Hcy血癥一直以來都是冠狀動脈硬化的預測因子。近年來，有研究表明，Hcy可能還是乳腺癌的一個危險因素：一方面，大多數乳腺癌患者缺乏維生素B12和葉酸，引起蛋氨酸代謝障礙，導致Hcy水平持續性升高；另一方面，高Hcy誘導DNA損傷，造成遺傳不穩定性，易導致乳腺癌，同時高Hcy可損傷內皮激活血小板，破壞凝血、抗凝血和纖溶系統，促進腫瘤細胞增殖[14?15]。目前，Hcy與乳腺癌相關基因的方法學比較文獻及聯合檢測對乳腺癌臨床診斷價值的報道較少見。

本研究采用循環酶法檢測Hcy，FQ?PCR法測定BRCA?1、hMAM和myc基因表達量，結果顯示，對照組Hcy水平和hMAM、BRCA?1、myc基因表達差異與良性乳腺病組均無顯著差異；乳腺癌組的BRCA?1基因表達顯著低于其他2組，而Hcy水平和hMAM、myc基因表達則顯著高于其他2組；在乳腺癌患者中，隨著臨床分期的增加，Hcy水平和hMAM、myc基因表達遞增，而BRCA?1基因表達遞減；4個指標聯合檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均顯著高于單個指標。

綜上所述，Hcy對乳腺癌的輔助診斷具有一定的臨床意義，若能結合相關基因的檢測，可明顯提高對乳腺癌診斷的檢出率。但是，基層醫院可能缺乏基因檢測的儀器，當Hcy水平異常升高時，在排除冠狀動脈硬化等心血管疾病時，應考慮到乳腺癌的可能，可結合臨床進一步確診。