重慶地區人群嗜鉻粒蛋白A第7外顯子多態性分布*

陳曉迎，張 丹，姜麗萍，羅 麗，古妮娜，劉景侖（重慶醫科大學附屬第一醫院急診/重癥醫學科，重慶400016）

嗜鉻粒蛋白家族的多種激素前蛋白與兒茶酚胺共同儲存于嗜鉻粒細胞的分泌小泡中，在交感興奮和應激情況下共同分泌進入血液和周圍組織，嗜鉻粒蛋白A（CHGA）是這個家族中含量最豐富、功能最重要的成員之一。CHGA由8個外顯子編碼的439個氨基酸組成，其基因位于人類染色體14q32。有研究顯示，CHGA基因上存在多個單核苷酸多態性（SNP）位點[1]。

CHGA在體內經蛋白酶水解為多個多肽片段，能夠發揮不同的生物學作用，其中第7外顯子負責編碼CHGA 252～412氨基酸序列。目前，已知CHGA第7外顯子基因編碼區存在4個較為重要的SNP位點，參與新型心血管活性肽，如兒茶酚抑素（CHGA352～372，CST）、Prochromacin（CHGA79～431）、胰抑素（CHGA254～301）和旁腺抑素（CHGA351～431）等多肽片段的序列形成。CST 是目前研究最多的CHGA衍生多肽，可調解兒茶酚胺的分泌，具有多種與心血管生理作用相關的生物學活性。CST由21個氨基酸組成，為帶有正電荷的疏水性蛋白，其野生型氨基酸序列為SSMKLSFRARAYGFRGPGPQL。已有研究表明，人類CST有3種具有不同活性的亞型：Gly364Ser、Pro370Leu 和 Arg374Gln，分別由 rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）和 rs9658669（A/G）3個 SNP 位點控制，其中以Gly364Ser亞型最為多見[2]。研究顯示，CST多態性與高血壓等疾病的發生及轉歸密切相關，越來越受到人們的重視[3-4]。另外，位于CHGA第7外顯子的SNP位點rs729940（T/C）編碼氨基酸Trp381Arg，參與CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素的一級結構組成，存在較高的突變率，該位點的突變對這些多肽片段功能影響的相關研究還未見報道。

第7編碼區的以上4個SNP位點均位于CHGA重要功能區，其在重慶地區漢族人群中的基因型分布特點還未有研究。鑒于CHGA功能的重要性和基因多態性對疾病發病機制的顯著影響，了解我國不同地區和群體CHGA的相關基因多態性的特征顯得非常有必要。本研究以重慶地區無血緣關系的漢族人群作為調查對象，旨在闡明CHGA第7外顯子的主要SNP等位基因分布情況，并為進一步研究CHGA的基因多態性與高血壓等疾病的易感性、發病機制和藥物療效等相關性提供基礎研究數據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2012年7月至2013年1月本院體檢健康者218例，年齡18～40歲，血壓均正常，均為漢族。其他地區數據來自美國國立生物技術信息中心。

1.1.2 主要試劑 全血總DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司，DNA Taq酶、DNA 1000標記物及引物均購自大連寶生物工程有限公司，Primer 5設計引物序列：上游為 5′-AGG GAA GGG AGA ACA G-3′，下游為5′-CGT TGT CCA GAA GGC AGT AGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及DNA提取 根據知情同意的原則，采集受試者外周靜脈血2 mL，嚴格按照全血基因組提取試劑盒說明書要求方法提取DNA，并儲存于-20℃備用。

1.2.2 聚合酶鏈反應（PCR）擴增及產物基因型鑒定應用上述引物和DNA樣本進行常規PCR反應，PCR反應體系為25 mL，反應條件：94℃4 min預變性，94℃變性 30 s，59℃退火 1 min，72℃延伸 45 s，共 35個循環，72℃延伸10 min。目的片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海美吉生物公司進行測序，并進行對應位點基因型鑒定。

1.3 統計學處理 統計CHGA第7外顯子4個SNP位點最小等位基因頻率（MAF），進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，應用SPSS19.0軟件進行基因型分布的計算分析，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DNA提取及目的片段擴增 采用萃取柱血液DNA提取試劑盒提取外周靜脈血DNA濃度可達到25～30 ng/mL，擴增后產物為658 bp，CHGA第7外顯子目的片段電泳圖見圖1。

圖1 CHGA第7外顯子目的片段電泳圖

2.2 CHGA第7外顯子SNP位點基因型鑒定 目的片段測序后對 rs9658667、rs9658668、rs9658669 和 rs729940共4個位點進行基因型鑒定。rs9658667位點發現2種基因型：野生型GG和突變雜合子GA型，見圖2。rs9658668、rs9658669 位點僅發現野生型 CC、GG，未發現突變型。rs729940共發現3種基因型：野生型CC型、突變雜合子CT型和突變純合子TT型，見圖3。

圖2 rs9658667位點測序結果及基因型分析

圖3 rs729940位點測序結果及基因型分析

2.3 CHGA第7外顯子SNP位點的等位基因頻率及基因型分布 218例漢族人群中，rs9658667位點GG基因型197例，GA基因型21例，AA基因型0例，MAF為0.0481；rs9658668位點CC基因型218例，CT基因型和TT基因型均為0例，MAF為0；rs9658669位點GG基因型218例，GA基因型和AA基因型均為0例，MAF為0；rs729940位點CC基因型144例，CT基因型67例，TT基因型7例，MAF為0.1857。該基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.954），可認為該樣本具有人群代表性。見表1。

表1 CHGA第7外顯子SNP位點的等位基因頻率及基因型分布

2.4 不同地區人群CHGA第7外顯子SNP的分布情況比較 重慶地區人群rs9658667位點A等位基因頻率明顯高于肯尼亞人群，差異有統計學意義（P=0.001），而與北京地區、意大利人群比較，差異均無統計學意義（P=0.185、0.117）；北京地區人群A等位基因頻率顯著高于意大利人群，差異有統計學意義（P=0.000）。重慶地區人群rs9658668位點未發現突變型；在NCBI數據庫中，亞洲、歐洲人群均未見突變型，非洲人群T等位基因頻率為0.018。重慶地區人群rs9658669位點未發現突變型；在NCBI數據庫中，亞洲、非洲人群均未見突變型，歐洲人群A等位基因頻率為0.010。重慶、北京地區人群rs729940位點T等位基因頻率明顯高于尼日利亞人群，差異均有統計學意義（P=0.000、0.000）。見表 2、3。

表2 不同地區人群rs9658667位點多態性分布

表3 不同地區人群rs729940位點多態性分布

3 討 論

CHGA具有調節兒茶酚胺釋放、抑制胰島素和甲狀旁腺激素分泌、抗菌及舒張血管等多種生物學活性，參與調節機體交感和應激功能，對心血管疾病、精神疾病及膿毒癥等疾病的發病和轉歸有著一定影響。有研究表明，血清CHGA的水平與高血壓的發病率及遠期預后、膿毒癥的嚴重程度密切相關[5-6]。

CHGA基因序列中存在多個SNP位點，位于編碼區的SNP位點可通過改變氨基酸序列，進而影響CHGA衍生片段的結構和功能，其中位于第7外顯子編碼序列上存在4個非同義SNP位點，分別改變了CST、Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素4個衍生多肽的氨基酸編碼。由于種族和地區遺傳環境差異，人類SNP位點多態性分布往往不同，我國僅在人類基因組計劃中對88例北京地區人群進行了小樣本的部分位點研究。本研究結果顯示，重慶地區人群rs9658667（A/G）、rs9658668（T/C）、rs9658669（A/G）和 rs729940（T/C）4 個位點的MAF 分別為：0.048、0.000、0.000和 0.186。在與 CST 序列相關的3個SNP位點中，重慶地區人群rs9658667（Gly364Ser）位點突變率顯著高于肯尼亞人群，而與北京地區、意大利人群比較無顯著差異；北京地區人群突變率顯著高于意大利人群；rs9658668（Pro370Leu）和rs9658669（Arg374Gln）兩位點未發現突變，與 NCBI數據庫中亞洲人群（北京地區、印度）在該位點無突變的情況相符合。

CHGA衍生片段CST是一種心血管保護活性肽，與多種心血管疾病的發生密切相關：（1）CST具有抑制高血壓發生的作用，可負反饋抑制嗜鉻粒細胞脫顆粒而減少兒茶酚胺釋放，維持自主神經系統正常功能[7]；（2）CST參與缺血性心臟病的發生，可通過促進心臟側支循環建立，抑制心肌細胞凋亡，拮抗心肌缺血再灌注損傷[8]；（3）CST與充血性心力衰竭發生有關，既能夠直接激動心肌β受體，又可拮抗異丙腎上腺素的收縮冠狀動脈和正性肌力等作用[9]。現代醫學認為，心血管疾病是遺傳因素和環境因素共同作用的復雜疾病，其中遺傳因素的貢獻作用占20%～55%[10]。CST的以上3個SNP位點被認為是原發高血壓等心血管疾病的易感基因。RAO 等[11]研究表明，rs9658667（Gly364Ser）位點突變后會改變人類交感神經和副交感神經神經的自律性，可能會降低高血壓的發病風險，尤其是對于男性。BISWAS[12]研究表明，黑種人群體 rs9658668（Pro370Leu）位點突變率比其他種族高，且該突變型群體高血壓發病風險較高，因而該基因型可能與黑人高血壓發病相關。CST的Pro370Leu突變型抑制兒茶酚胺釋放作用最強，野生型次之，Arg374Gln突變型作用最弱[13]。除此之外，不同亞型還對心肌細胞和內皮細胞抗腎上腺素能效應、一氧化氮的釋放、缺血再灌注等產生不同影響[8]。因此，遺傳基礎的不同導致CST結構及功能差異，進而可能導致與CST密切相關的疾病發生及轉歸不同。rs9658667（Gly364Ser）位點的多態性分布差異是否對重慶地區高血壓等心血管疾病的發病率產生影響還需進一步研究。本研究結果顯示，CHGA第7外顯子上的另外一個SNP位點rs729940（Trp381Arg）的突變率較高，且與尼日利亞人群顯著不同，該位點參與CHGA衍生多肽Prochromacin、胰抑素和旁腺抑素一級結構構成。至今為止，尚缺乏該位點多態性對衍生片段功能產生影響的證據，但IIJIMA等[14]的研究已表明，該位點與CHGA啟動子rs9658635位點組成的單體型與日本人精神分裂癥的發病顯著相關，其具體機制尚不清楚。因此，該位點變異對CHGA衍生片段功能的影響，以及在漢族人群中與精神分裂癥等相關疾病的關系有待進一步研究。

綜上所述，rs9658667、rs729940位點等位基因頻率具有一定種族地區差異，而rs9658668、rs9658669位點無突變。本研究提供了重慶地區健康漢族人群CHGA第7外顯子基因多態性的分布規律，為進一步進行該基因多態性與高血壓等疾病的關聯研究提供了重要的流行病學基礎資料。