HOXA13基因在胃癌中的表達及其臨床意義

方美玲，寇繼光，萬遠太△

(1.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院消化內科，武漢 430000；2.武漢科技大學附屬孝感市中心醫(yī)院消化內科，湖北孝感 432000)

胃癌發(fā)病率居消化道惡性腫瘤首位，但胃癌早期病變多呈隱匿性經過，缺乏特異性，當臨床癥狀明顯時，多已進展到中晚期[1]。 一直以來，人們對腫瘤標志物進行不斷的研究，尋找一種新的簡單、快捷、靈敏、便于動態(tài)監(jiān)測的腫瘤標志物，對協助早期診斷及預后判斷具有臨床指導意義。同源盒基因(homeoboxgene,HOX)A13異常表達及表達產物在多種腫瘤性疾病中可能具有診斷和判斷疾病預后的重要意義[2]。文獻報道，HOXA13與肝癌、胰腺癌、食管鱗癌、卵巢癌等惡性腫瘤均具有較好的相關性[3-7]， 但與胃癌之間的關系甚少涉及。本研究采用免疫組織化學(IHC)染色法檢測HOXA13在胃腺癌中的表達情況，旨在通過分析HOXA13蛋白與胃腺癌各臨床病理因素及預后之間的關系。為判斷 HOXA13基因能否作為一種具有價值的腫瘤分子標記物提供證據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集武漢科技大學附屬孝感市中心醫(yī)院普外科2011年12月至2017年6月經手術治療的胃癌患者的臨床病例資料，選擇病檢結果為胃腺癌的66份石蠟包埋組織標本(胃癌組)，所有患者術前均行胃鏡檢查且未接受放化療及其他輔助治療，術后病檢結果符合美國癌癥聯合會(AJCC)與國際抗癌聯盟(UICC)臨床分期標準。另選擇胃內鏡黏膜下剝離術(ESD)術后病檢為胃癌癌前病變組織(上皮內瘤變)20份(癌前組)、胃鏡下活檢為正常胃黏膜組織20份(對照組)的石蠟包埋組織標本。臨床病例資料及隨訪資料完整。行胃鏡檢查且未接受放化療及其他輔助治療，術后病檢結果符合美國癌癥聯合會(AJCC)與國際抗癌聯盟(UICC)臨床分期標準。另選擇胃內鏡黏膜下剝離術(ESD)術后病檢為胃癌癌前病變組織(上皮內瘤變)20份(癌前組)、胃鏡下活檢為正常胃黏膜組織20份(對照組)的石蠟包埋組織標本。臨床病例資料及隨訪資料完整。

A:對照組;B:癌前組;C:胃癌組

1.2方法

1.2.1IHC染色 石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2孵化10 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液沖洗5 min，共3次；乙二酸四乙酸(EDTA)抗原修復液(pH8.0)經高壓鍋加熱至沸騰并將標本修復，用5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液常溫下孵育2 h；一抗[兔抗人HOXA13多克隆抗體(稀釋濃度為1∶200)，購自美國Abcam公司；Ki-67購自北京中杉金橋公司]4 ℃孵育過夜，PBS緩沖液沖洗10 min，共3次，二抗[生物素標記山羊兔IgG(購自博士德生物工程有限公司)]室溫下孵化30 min,PBS緩沖液沖洗10 min，共3次。二氨基聯苯胺(DAB)染色8 min，自來水充分沖洗，蘇木素復染、水洗，稀鹽酸分色、反藍、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

1.2.2結果判定 IHC染色后切片由兩位不了解研究內容及標本信息的病理科診斷醫(yī)生進行結果判斷。IHC染色等級評分：0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中等陽性，3分為強陽性；染色范圍等級評分：0～<1%為0分，1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%～100%為4分；根據以上兩個評分總和再分為3組： 0～1分判定為陰性表達，>1～4分判定為弱陽性表達，>4～7分判定為強陽性表達。 其中陽性包括弱陽性及強陽性。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料以率表示，組間比較采取χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組標本組織中HOXA13蛋白表達比較 HOXA13蛋白在胃腺癌中的表達部位主要在癌細胞的細胞核，亦有少部分細胞質表達。HOXA13蛋白在對照組、癌前組、胃癌組的陽性表達率分別為5.00%(1/20)、30.00%(6/20)、74.24%(49/66)，3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各組標本組織中HOXA13蛋白表達，見圖1。

2.2HOXA13蛋白表達與胃腺癌患者不同臨床病理特征的關系 HOXA13蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無明顯相關性(P>0.05)；與胃腺癌的T、N分期及UICC分期明顯相關(P<0.05),見表1。

表1 HOXA13表達與患者臨床特征間的關系[n(%)]

2.3胃腺癌患者HOXA13與Ki-67蛋白表達的相關性分析 胃腺癌患者中HOXA13與Ki-67蛋白表達，具有明顯相關性(r=0.472，P<0.05)，見表2。

表2 患者HOXA13與Ki-67表達的相關性分析[n(%)，n=66]

3 討 論

HOX首先在果蠅體內發(fā)現,在包括人在內的動物的胚胎發(fā)育和細胞分化中發(fā)揮重要作用的一類基因,該基因序列中含180～183個堿基組成的保守序列，該序列編碼的60～61個氨基酸所構成的保守序列，成為同源結構域或同源盒。HOX屬于Ⅰ類同源異型盒基因，具有高度保護性，根據序列的相似性及在染色體上的位置，可以將COX分為A、B、C、D四族。分別位于7(HOXA)、17(HOXB)、12(HOXC)、2(HOXD)號染色體上,根據族間序列的相似性及基因在染色體上的位置又可分為13組，目前已鑒定的哺乳類動物的HOX共有39個基因[8-12]。

HOXA13基因屬于HOXA家族中的一員，位于7號染色體的5′末端，正常情況下，其對胚胎時期四肢的發(fā)育、生殖系統(tǒng)的形成和組織血管的形成具有重要作用。HOXA末端的轉錄物(HOTTIP)是一段非編碼的RNA,也是多種腫瘤疾病的癌基因，HOTTIP沉默在體內外通過降低Bcl-2和加強Bax表達抑制細胞存活通路，HOTTIP抑制cycling D1的表達和促使細胞周期阻滯在G0/G1期。向下調節(jié)HOTTIP可導致HOXA13的表達降低[4-5，13-14]。目前對于HOXA13引起胃癌發(fā)生、發(fā)展的機制也有其他相關的研究，HOXA13通過轉化因子β信號通路(TGF-β)增加胃癌細胞入侵和上皮-間葉細胞之間的轉化(EMT)[15]；HOXA13通過HOXA聯合靶點反式激活胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)，從而提高胃癌細胞的致癌性和侵襲性；HOXA13通過調節(jié)鈣黏蛋白-17(CDH17)激活Wnt-βcatenin信號通路上調DKK1、cmyc、cyclinD1的表達促進胃癌細胞的增殖等[16-17]。HOXA13可能成為新的胃腺癌早期診斷血清學分子標記物[18]。

本研究結果顯示，HOXA13蛋白在胃腺癌中的表達明顯高于胃癌癌前病變組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在正常胃黏膜組織中，HOXA13蛋白幾乎不表達；HOXA13蛋白過表達與胃腺癌T、N分期及UICC分期具有相關性，病理分期越高，HOXA13表達逐步增強，表明HOXA13在腫瘤擴散過程中可能有重要影響。

Ki-67基因位于第10號染色體上，與細胞增殖有明顯相關性，其表達產物為細胞核內的對蛋白酶極其敏感的大分子蛋白質分子，該基因在除G0期以外的細胞各增殖周期中都有表達，包括G1、S、G2、M期。有研究發(fā)現隨著細胞增殖周期的逐漸發(fā)展，Ki-67的表達不斷增加，于M期達高峰，有絲分裂后期Ki-67表達量則快速下降，該研究認為Ki-67通過與染色體相連參與細胞有絲分裂，Ki-67抗原在M期后的細胞中迅速消失。由此可見，Ki-67可以作為評價細胞增殖的一個敏感指標[19]。本研究顯示，HOXA13蛋白表達與Ki-67蛋白表達存在相關性(r=0.472，P<0.01)，HOXA13蛋白增加可能在評價胃腺癌細胞增殖分化有臨床意義的說服力。

在人體其他系統(tǒng)腫瘤中，HOXA13基因的研究也不少，如前列腺癌[20]、卵巢癌[7]、T細胞急性淋巴細胞白血病[21]等，HOX基因家族與腫瘤發(fā)病機制的研究日益受到重視，特別是HOXA13/HOTTIP，但其與腫瘤發(fā)病機制和信號調節(jié)通路仍不清楚，需要進一步研究，HOXA13/HOTTIP可能為以后腫瘤性疾病的早期診斷提供分子生物學標志物及預測腫瘤預后的標志物之一。同時，HOXA13作為促進腫瘤增殖、侵襲轉移的一個獨立影響因子，提示其可能作為腫瘤基因靶向治療的一個有效靶點。

目前對HOXA13在消化道及其他系統(tǒng)腫瘤的研究缺乏具體的機制研究，闡明HOXA13與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后仍需進一步的研究和探討，隨著研究的不斷深入，HOXA13有待成為腫瘤診斷和治療提供新的基因靶點。