ADAM33基因S1、S2位點多態性與新疆維吾爾族COPD的相關性

王 菲，胡 昕，齊曼古力·吾守爾，孫 慧，王 晶

(新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸科，烏魯木齊 830054)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種由有害顆粒導致的肺部異常炎癥的呼吸道疾病，癥狀持續存在，其以不完全可逆且進行性發展的氣流受限為特點[1]；到2020年，預計COPD將居升全球死亡原因第3位[2]，其防治工作刻不容緩。目前COPD的發病機制尚不全部明了，多項研究證實遺傳因素與其發病機制相關。GOSMAN等[3]于2007年首次指出ADAM33基因的單核苷酸多態性(single nucleotide poly-morphisms,SNPs)通過影響氣道的高反應性、炎癥從而參與COPD病理、生理過程。由于地域、種族、研究對象選取等不同,ADAM 33基因的SNPs與COPD的相關性研究結果存在差異，目前仍在探索中。本研究旨在探討ADAM33基因S1、S2位點的SNPs與新疆地區維吾爾族COPD患者易感性及肺功能下降的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年6月至 2013年6月就診于本院呼吸內科，確診為COPD的維吾爾族患者100例作為觀察組，其中男 41例，女 59 例，年齡(58.73±15.19)歲；納入標準：COPD患者診斷參照文獻[4]，且患者入組前均未接受過藥物正規治療。排除標準：排除合并支氣管哮喘、 支氣管擴張、 間質性肺疾病、結核、肺癌、心血管疾病等病史的患者。選取同期140例維吾爾族健康體檢者作為對照組，其中男54例，女86例；年齡(57.44±14.72)歲。兩組對象年齡、性別、吸煙指數比較，差異均無統計學意義 (P>0.05)；兩組對象第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)、FEV1占預計值百分比比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。資料采集及處理采用雙盲原則進行；該研究經醫院倫理委員會審核批準，受試對象均知情并簽署知情同意書。

表1 兩組對象臨床相關資料比較

1.2方法

1.2.1DNA的提取及鑒定 采集研究對象空腹外周靜脈血5 mL，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，放置于-80 ℃保存。 采用非離心柱型血DNA提取試劑盒的提取DNA，同時采用超微量分光光度計檢測提取的DNA純度和濃度。

1.2.2聚合酶鏈反應(PCR) 引物序列來源NCBI數據庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。引物由上海生工生物有限公司合成。S1位點上游引物：5′-CTG GGA GTC GGT AGC AAC AC-3′，下游引物：5′-CCT GTG CAG GCT GAA AGT ATG-3′;S2位點上游引物：5′-CTC GGA GCC TAC CCA CTG C-3′，下游引物：5′-CCG CAG ACC ATG ACA CCT TC-3′。反應體系為50 μL，包括DNA 1.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，Taq Buffer 5 μL、MgCl2(25 mmol/L) 5 μL、Taq酶5 μL，其余為雙蒸水。 擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55～65 ℃退火35 s；72 ℃延伸40 s；72 ℃修復延伸5 min；35個循環數。1%瓊脂糖電泳20 min，電泳觀察是否擴增成功。

1.2.3限制性片段長度多態性(RFLP)檢測 對PCR擴增產物進行酶切,使用RFLP檢測。 酶切體系為15 μL，包括PCR產物10 μL，限制性內切酶0.1 μL，10×Buffer 1.5 μL，余為雙蒸水，恒溫37 ℃，水浴過夜。酶切產物在TBE緩沖液中電泳30 min，條件為2%瓊脂糖凝膠、100 V電壓，凝膠圖像系統對結果的進行分析，得出基因型。

1.2.4測序分析 將擴增片段使用生工SK1141試劑盒進行測序，測序結果采用BLAST軟件與數據庫錄入的序列分析同源性，驗證得到的擴增基因片段正確性。

1.2.5肺功能檢測 兩組對象均進行基礎肺功能及支氣管舒張試驗肺功能的測定，肺功能檢測儀器為德國Yeager生產，支氣管擴張劑使用沙丁胺醇，檢測用藥前后的FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEV1/預計值%等指標。

2 結 果

2.1S1、S2位點基因型檢測及測序結果 對所有研究對象進行基因型檢測，ADAM33基因S1位點基因的擴增產物為192 bp DNA片段；S2位點基因的擴增產物為166 bp DNA片段。經2%瓊脂糖凝膠電泳后，S1位點有3種基因型CC(166 bp)、TT(128、38 bp)、CT(166、128、38 bp)；S2位點也有3種基因型CC(166 bp)、GG(102、64 bp)、CG(166、102、64 bp)。驗證PCR擴增基因片段的正確性測序結果，見圖1。

圖1 S1、S2位點部分測序結果

2.2遺傳平衡符合性檢驗 對兩組對象χ2檢驗驗證S1、S2位點的基因型分布，其均符合 HarDY-Weinerg遺傳平衡(χ2=0.29、0.62，P>0.05)，表明樣本具有群體代表性。

表2 S1、S2位點基因型與等位基因頻率分布比較[n(%)]

2.3兩組對象S1、S2位點基因型和等位基因頻率分布比較 S1位點的基因型和等位基因頻率分布兩組對象比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組對象S2位點的基因型及等位基因的頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4S1位點基因型的SNPs與COPD易感的相關性分析 Logistic回歸分析顯示，攜帶突變基因T的基因型(包括CT、TT)和野生基因型(CC)比較，前者能明顯降低COPD發生的危險性(OR=0.12，95%CI：0.02～0.59)，見表3。

2.5兩組對象基因位點的單體型和連鎖不平衡 對基因S1、S2位點進行單倍體型匹配，得到4種單倍體型，其中單體型H1(CC型)、H3(CG)兩組對象比較差異無統計學意義(P=0.55、0.22)；單倍體型H2(TC型)、H4(TG)中，觀察組的基因型頻率小于0.05，故不分析，見表4。S1、S2多態性位點間存在連鎖不平衡(D′=0.47，r2=0.04)。

表3 S1位點不同基因型與發生COPD的相關性[n(%)]

表4 S1、S2位點單體型基因頻率分析[n(%)]

2.6S1位點的SNPs與COPD患者肺功能相關指標的關系 S1位點攜帶突變基因T的基因型(CT、TT)和野生基因型(CC)患者的FEV1/FVC、FEV1/預計值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 觀察組S1位點不同基因型與肺功能指標的關系

3 討 論

GOSMAN等[3]于2007年首次指出ADAM33基因的SNPs與COPD相關，開啟了該疾病新的研究方向。ADAM33基因表達具有一定的組織特異性，UMLAND等[6]發現其主要表達于成纖維細胞、平滑肌細胞和肌纖維細胞。DIJKSTRA等[7]在肺組織中的基底上皮細胞和血管內皮細胞檢測到其表達，對于生長因子、炎癥介質的釋放也有參與，考慮ADAM33基因參與了氣道重塑、炎癥反應和血管的生成。

近年國內外對ADAM33的SNPs與COPD相關性的研究結果不一。目前研究轉向至不同地域、不同民族等差異。LAXMI等[8]得出結論印度人群ADAM33的 S1、S2位點多態性在COPD病因遺傳因素起重要作用。當然ADAM33基因的SNPs與COPD存在相關性受到很多學者質疑。目前對ADAM33基因S1、S2位點與COPD之間關系存在異議，PABAT等[9]發現在德國人中ADAM33基因S2位點SNPs對COPD發展過程無影響，與其不相關。有研究表明新疆地區維吾爾族人群COPD高發[10]，本研究選取該地區COPD患者進行分析，探討其與ADAM33基因S1、S2位點SNPs的相關性，得出S1、S2位點基因型樣本具有群體代表性，在新疆地區維吾爾族人群中COPD與ADAM33基因S1位點相關。考慮不同地區、不同種族COPD患者與ADAM33基因S1、S2位點SNPs的關系有所不同，值得進一步深究。

TAN等[11]發現位于中國內蒙古地區蒙古族ADAM33 的S2、S1位點SNPs與COPD易感性有關。AIERKEN等[12]對不同民族、地域的ADAM33基因SNPs研究結果進行Mata分析，結果提示亞洲人種中ADAM33基因中S1與發生COPD危險性有關，而在歐洲人種中不相關。S2 與任何人種發生COPD的危險都無關。ZHOU等[13]對5篇關于歐洲人種和8篇關于亞洲人種的13個研究進行分析，得出S1位點SNPs與亞洲人種、歐洲人種發生COPD危險性有關；ZHANG等[14]通過不同民族、地域分類進行Meta分析，得出S1位點SNPs是中國吸煙人群發生COPD的危險相關遺傳因素之一。本研究得出ADAM33基因的S1位點SNPs與新疆地區維吾爾族人群COPD的危險性相關，并且推測S1位點突變基因T等位基因可能為該人群COPD發病的保護性遺傳因素。本研究未得出S2位點SNPs與新疆地區維吾爾族人群發生COPD的相關性，故S2位點SNPs與COPD的關聯性尚不確定。

本研究對ADAM33基因S1、S2位點進行單倍體型分析，其單倍體型與新疆地區維吾爾族人群COPD發生無關聯。EL-ZAHER等[15]研究埃及人群COPD吸煙患者的ADAM33基因發現其S1與肺功能下降明顯相關。根據本研究得出S1位點SNPs與新疆地區維吾爾族COPD患者肺功能中FEV1/FVC、FEV1/預計值不相關。首先考慮本研究樣本量尚不夠多，需擴大樣本量進一步深入研究；其次不排除地域、種族的差異導致的差異性。