黃芪-葛根配伍對葛根素在2型糖尿病大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響

袁麗君，涂 星,2△，佟智斌，譚 紅，邱路雅，李 瑩

(1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥系，湖北恩施 445000；2.風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施 445000)

黃芪-葛根為臨床常用對藥，起源于清代名醫(yī)李用粹的《證治匯補(bǔ)》卷三，以黃芪一兩、葛根五錢組成；后張錫純在《西學(xué)衷中參西錄》中的玉液湯選用黃芪五錢、葛根一錢半以治療消渴癥[1]；現(xiàn)代臨床常用于治療氣陰兩虛之高血壓、糖尿病和卒中后遺癥等[2]，尤其適用于糖尿病合并高血壓、冠心病和腦血管病變的患者[3]。王春怡等[4]研究發(fā)現(xiàn)該藥對通過降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高糖耐量、增加小鼠對胰島素的敏感指數(shù)和降低胰島素抵抗(IR)指數(shù)，同時下調(diào)血脂和血清中游離脂肪酸的水平，發(fā)揮治療糖尿病及IR作用。現(xiàn)代研究還證實(shí)，黃芪-葛根配伍對肝臟糖脂代謝、胃黏膜損傷、糖尿病腎病(DN)、糖尿病心肌病、神經(jīng)根型頸椎病等都具有較好的治療或保護(hù)作用[5-9]。而黃芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍是否對其主要有效成分葛根素的代謝存在影響，本研究擬通過對糖尿病大鼠體內(nèi)葛根素的藥代藥動學(xué)研究，探討其體內(nèi)動力學(xué)特征，為黃芪-葛根臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄各半，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2儀器 LC-2030C高效液相色譜儀(四元梯度高壓輸液系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、二極管陣列檢測系統(tǒng)等)購自日本島津公司，BSA224S-CW十萬分之一電子分析天平購自塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，VX-200渦旋混合儀器購自美國Labnet公司，5810R高速低溫冷凍離心機(jī)購自德國eppendorf公司，Milli-Q超純水系統(tǒng)購自貝徠美生物科技有限公司，KQ2200E型超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司，BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士步琦公司，低溫冰箱購自河南新飛電器集團(tuán)有限公司。

1.1.3藥物與試劑 葛根、黃芪中藥飲片，購于恩施宏升大藥房，經(jīng)湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院朱敏英教授鑒定分別來源于豆科植物甘葛藤PuerariathomsoniiBenth.的根和豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的根；葛根素對照品(批號：110752-201615)，購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為去離子超純水；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.12型糖尿病(T2MD)大鼠模型的建立和分組 將SD大鼠40只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組(10只)和造模組(30只)。造模組采用腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，用pH4.2檸檬酸鈉緩沖液配制成0.25%(現(xiàn)配現(xiàn)用)，3 d后斷尾取血，用血糖儀檢測隨機(jī)血糖水平。以大鼠血糖大于或等于16.7 mmol/L為成功模型大鼠。對照組大鼠腹腔等量注射pH為4.2檸檬酸鈉緩沖液。結(jié)果造模成功大鼠26只，剔除血糖值過高(≥26.0 mmol/L)2只，將剩余24只大鼠隨機(jī)分為葛根組(黃芪葛根0∶1)、黃芪葛根A組(黃芪-葛根2∶1)、黃芪葛根B組(黃芪葛根3∶1)，每組8只。

1.2.2給藥、樣品采集和處理 按照黃芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)，固定葛根用量，稱取藥材，加10倍量水煎煮1.5 h，濾過，濾渣加8倍量水煎煮0.5 h，濾過，合并兩次濾液，減壓濃縮至含生藥量1.0 g/mL。黃芪-葛根不同配比(3∶1、2∶1、0∶1)組禁食不禁水12 h后，分別灌胃給予相應(yīng)的水煎液(給藥量折合葛根素為200 mg/kg)；對照組(8只)同法給予黃芪-葛根0∶1水煎液，另2只大鼠麻醉后腹主動脈采集空白血15份于1.5 mL抗凝管中。于給藥后0、2、5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、300、360、420 min以肝素鈉浸泡過的毛細(xì)管眼球后靜脈叢采血0.3 mL于1.5 mL抗凝管中，于高速冷凍離心機(jī)中15 000 r/min離心15 min，分離血漿。精密移取分離的血漿100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，渦旋震蕩3 min，于高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.2.3高效液相色譜法(HPLC)檢測血漿中葛根素水平分析方法建立 (1)色譜條件：色譜柱為SinoChrom ODS-BP柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(35∶65)；流速1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。(2)適用性實(shí)驗(yàn)：在該色譜條件下，取對照品溶液(1 000 μg/mL)、供試品溶液和空白血漿，分別按照上述色譜條件進(jìn)樣，考察待測峰的保留時間、分離度和理論塔板數(shù)。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制 精密稱取置于P2O5中干燥至恒質(zhì)量的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL對照品儲備液，50、100、200、400、600、1 000、2 000、3 000 μL于10 mL容量瓶，加30%乙醇定容刻度，即得系列濃度的對照品溶液。

1.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取1.2.4項(xiàng)下5、20、100 μg/mL的葛根素對照品溶液，按1.2.3項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積計(jì)算穩(wěn)定性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取葛根組及黃芪葛根A、B組10 min時的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h后按1.2.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣3次，測定峰面積，以平均峰面積計(jì)算穩(wěn)定性RSD。

1.2.7回收率實(shí)驗(yàn) 另取正常大鼠空白血9份分為3組，分別加入葛根素標(biāo)準(zhǔn)品1、2、4 mg，于高速冷凍離心機(jī)中15 000 r/min離心15 min，分離血漿，精密移取分離的血漿100 μL于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈-甲醇(1∶9，V/V)溶液，渦旋震蕩3 min，于高速冷凍離心機(jī)中15 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，按1.2.3項(xiàng)下進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率。

1.2.8解凍-凍融穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取葛根組及黃芪葛根A、B組10 min時的供試品溶液，置于-18 ℃冰箱中存放6 h，室溫放置解凍，循環(huán)3次后，按1.2.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣3次，測定峰面積，以平均峰面積計(jì)算穩(wěn)定性RSD。

1.2.9藥物動力學(xué)(PK)模型的擬合 采用PKsovler軟件繪制藥-時曲線，對各組大鼠血漿中葛根素的血藥濃度-時間關(guān)系進(jìn)行PK房室模型擬合，以Akaikei′s信息量準(zhǔn)則值(AIC)、殘差平方和值(RSS)、擬合度決定系數(shù)(R2)指標(biāo)篩選最佳房室模型(RSS越小，R2越大，AIC越小表明所建立的模型越佳)，輸出PK相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組血漿中葛根素水平 在HPLC條件下，葛根素的保留時間約為3.95 min，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)以葛根素計(jì)不少于4 000，表明血漿樣本中葛根素分離度良好，空白血漿其他成分無明顯干擾。各組血漿中葛根素水平，見圖1。

A:葛根對照品溶液;B:空白血漿;C：葛根單煎液血漿樣品供試液;D：黃芪-葛根配伍血漿樣品供試液

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將對照品溶液按1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以對照品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果求得回歸方程為Y=66 448.986 7X-175 666.002 4，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，表明葛根素在5～300 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.33組供試品精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為0.671%、0.293%、1.414%，表明儀器精密度良好。

2.43組供試品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為2.612%、2.791%、2.592%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.53組供試品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 葛根組及黃芪葛根A、B組平均回收率分別為96.14%、97.22%、99.04%，RSD分別為2.65%、2.69%、2.45%，表明回收率良好。

2.63組供試品解凍-凍融穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 葛根組及黃芪葛根A、B組RSD分別為1.06%、1.10%、0.98%，表明反復(fù)冷凍、融化對樣品無明顯影響。

2.7PK模型的擬合 各組大鼠血漿中葛根素的血藥濃度-時間關(guān)系經(jīng)擬合，綜合考慮RSS、R2和AIC，確定葛根素的最佳房室模型均為一室模型，結(jié)果見表1；其藥-時曲線見圖2，其PK參數(shù)見表2。對照組大鼠灌胃給予葛根水煎液后，葛根素在其體內(nèi)的吸收較快，而在糖尿病大鼠體內(nèi)的吸收會減緩(P<0.05)、消除時間和達(dá)峰時間(Tmax)延長(P<0.05)，0～420 min生物利用度(AUC0-420)、時間曲線下面積(AUMC)、平均滯留時間(MRT)均明顯增加(P<0.05)，表觀分布容積(V/F)和表觀清除率(CL/F)無明顯性差異。在糖尿病大鼠中，與黃芪葛根0∶1比較，黃芪-葛根以2∶1和3∶1比例配伍時，葛根素體內(nèi)吸收速率加快(P<0.05)，而消除時間、V/F、CL/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明顯增加(P<0.05)，但Tmax和高峰濃度(Cmax)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且黃芪-葛根以3∶1比例配伍時上述指標(biāo)變化更明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠葛根素的藥動學(xué)隔室模型判斷指標(biāo)

表2 各組大鼠血漿中葛根素的房室模型PK參數(shù)

續(xù)表2 各組大鼠血漿中葛根素的房室模型PK參數(shù)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與葛根組比較；c:P<0.05,與黃芪葛根A組比較

A:對照組(葛根-黃芪0∶1);B:葛根組;C:黃芪葛根A組;D:黃芪葛根B組

3 討 論

糖尿病是由于胰島素分泌缺乏和(或)胰島素生物效應(yīng)受損而引起的以慢性高血糖為主癥，同時伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)紊亂的代謝性疾病，屬于中醫(yī)“消渴證”范疇。黃芪和葛根是治消渴古方中配伍的常用藥味，其中黃芪“甘溫益元?dú)猓蕼爻鬅幔释ㄖ髦粴馔鷦t津液生，故止渴”。而葛根“治脾胃虛而渴，除胃熱，善解酒毒，通行足陽明經(jīng)之藥”，故常作為藥對使用。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-葛根藥對在糖尿病上廣泛使用，對其并發(fā)癥諸如DN、糖尿病心肌病、糖尿病IR、糖尿病肝病等具有較好的治療作用[10-12]，且對胃黏膜損傷具有一定的保護(hù)作用[6]。而葛根素為葛根干燥根莖提取的一類黃酮化合物，研究表明葛根素具有改善高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，維持心室肌細(xì)胞的功能，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元以延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變等作用[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素在健康大鼠和糖尿病大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為存在明顯差異。與健康大鼠比較，葛根素在糖尿病大鼠體內(nèi)的吸收半衰期、消除半衰期和Tmax延長(P<0.05)，AUC0-420、AUMC、MRT明顯增加(P<0.05)，表明葛根素在糖尿病大鼠體內(nèi)的生物利用度增加，MRT更長，提示在糖尿病患者服用葛根素時應(yīng)注意給藥間隔，避免藥物蓄積引起不良反應(yīng)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍時，葛根素在糖尿病大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為均存在明顯差異。主要表現(xiàn)為黃芪-葛根配伍使用時相對于單用葛根吸收半衰期和Tmax明顯縮短(P<0.05)，CL/F明顯降低(P<0.05)，而消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT均明顯增加(P<0.05)，吸收半衰期和Tmax的縮短提示二者配伍后可有效加快葛根素的吸收，快速發(fā)揮治療作用；而AUC0-420、AUMC的增加提示二者配伍后增加了葛根素的生物利用度，可能提高了治療糖尿病效果；MRT和消除半衰期的延長提示二者配伍后葛根素在體內(nèi)的代謝時間延長，有助于延長藥效作用時間。該結(jié)果提示黃芪與葛根配伍增效的作用機(jī)制可能與黃芪改變葛根藥動學(xué)參數(shù)有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪-葛根以2∶1、3∶1比例與0∶1比例配伍時比較，葛根素吸收Cmax、半衰期、Tmax、CL/F、消除半衰期等均有明顯變化，提示黃芪可以延長葛根素在大鼠體內(nèi)吸收半衰期，從而增加葛根素的治療時間。黃芪-葛根以0∶1、2∶1和3∶1比例配伍時Cmax及Tmax均無明顯差異，表明葛根素在體內(nèi)吸收可能具有飽和現(xiàn)象，提示其在體內(nèi)的吸收可能除了被動吸收外，還存在主動轉(zhuǎn)運(yùn)和易化擴(kuò)散等多種方式。黃芪-葛根以3∶1比例配伍時消除半衰期、V/F、AUC0-420、AUMC、MRT等參數(shù)的變化較黃芪-葛根2∶1配伍時變化更明顯(P<0.05)，證實(shí)了黃芪-葛根的配伍比例可影響葛根素在體內(nèi)的藥動學(xué)行為。

綜上所述，本研究從藥動學(xué)行為上驗(yàn)證了黃芪-葛根以2∶1和3∶1的比例配伍時與單用葛根時體內(nèi)藥動學(xué)行為存在明顯差異，二者配伍時黃芪可有效提高葛根素在大鼠體內(nèi)的生物利用度，減緩消除時間，延長藥物作用時間而達(dá)到協(xié)同增效的目的。