人源CerS2重組腺病毒構建及其對肝癌細胞HepG2細胞周期的作用

楊小理，錢 玥，歐陽旭紅，向加林，楊 艷，王鳳學

(1.遵義醫學院附屬醫院醫學檢驗科，貴州遵義 563003；2.遵義醫學院檢驗醫學院2015級，貴州遵義 563003； 3.貴州省遵義市第一人民醫院檢驗科 563003)

神經酰胺合酶(ceramide synthase，CerS)基因家族成員主要包括CerS1、CerS2、CerS4、CerS5、CerS6[1-3]，各成員在真核生物中呈現出嚴格的保守性[4]。CerS2參與神經酰胺的合成[5]，神經酰胺作為鞘磷脂信號途徑中重要的第二信使效應分子，參與激活多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶調節凋亡、增殖、分化和生長停滯等信號過程[6]。研究表明，CerS2在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌細胞株中具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲的活性[7-10]，且較多研究關注CerS2在腫瘤微環境的作用及機制探討。而CerS對動物來說是很重要的相關基因，其變異將導致嚴重的代謝紊亂，但CerS2在腫瘤與代謝中的作用卻鮮有報道。本研究通過構建人源CerS2重組腺病毒，觀察其對肝癌細胞HepG2的轉染、介導CerS2基因的表達能力及對細胞周期的影響，為進一步研究CerS2基因對HepG2細胞生長及肝糖、脂質代謝可能的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 限制性內切酶、感受態大腸埃希菌DH5α、引物合成、RT-PCR、QPCR試劑盒均購自大連寶生物Takara公司；HEK293購自上海中科院細胞庫，AdMax重組腺病毒表達載體購自加拿大Microbix公司；DMEM、胎牛血清、胰酶均購自Gibico公司；脂質體2000購自Invitrogen公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒均購自Omega公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基生物技術有限公司；蛋白Marker為Fermentas產品，內參抗體為Anti-β-actin-HRP-conjugated，購自康成；Anti-Ceramide synthase 2抗體、Anti-p27 kip 1抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1人源CerS2基因的擴增 從Genebank檢索人源基因序列即NM_181746，送公司化學合成CDS區全長片段。取1 μL作為模板，用PrimerSTAR進行目的片段PCR擴增，上游引物：5′-CGT AGA ACG CAG ATC GAA TTC GCC ACC ATG CTC CAG ACC TTG TAT GA-3′；下游引物：5′-CCA TGG TGG CAA GCT TGT CAT TCT TAC GAT GGT TGT TAT T-3′。

1.2.2穿梭質粒pDC315-CerS2-GFP的構建及重組質粒的篩選與鑒定 采用1.0%的瓊脂糖電泳PCR產物，對PCR產物進行回收、純化，同時將pDC315-綠色熒光蛋白(GFP)、PCR產物線性化，并經In-Fusion交換酶連接、轉化、選取陽性克隆經PCR鑒定且送大連寶生物測序。

1.2.3重組腺病毒pDC315-CerS2的包裝 將穿梭質粒pDC315-CerS2與Admax系統中pBHGloxpΔE1,3cre載體共轉染293細胞，觀察細胞狀態，第14天左右出現細胞病變(cytopathic effect，CPE)，待所有細胞都變圓并大部分開始脫落時，收集上清液和細胞，離心后保留細胞和2 mL上清液，用液氮和37 ℃水浴鍋反復凍融樣品3次，離心去沉淀。加入10% 無菌甘油，過濾后得到病毒毒種，保存在-80 ℃。

1.2.4Adv-CerS2-GFP的擴增、純化與滴度鑒定 待293細胞接近長滿時，加入毒種1 mL，當大部分細胞出現CPE且脫落時，收集病毒上清液，再次擴增，重組腺病毒經Adeno-X Virus Purification Kit純化試劑盒純化，保存在-80 ℃。采用終點稀釋法，計算病毒滴度。

1.2.5Adv-CerS2-GFP在肝癌細胞HepG2中的表達及亞細胞定位 在6孔板中細胞爬片，將Adv-GFP(空載組)、Adv-CerS2-GFP(實驗組)分別感染HepG2細胞，并設HepG2空白對照組，感染48 h后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，并采用DAPI染核，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察與拍照，藍光激發和發射波長分別為340 nm/488 nm，GFP激發和發射波長為488 nm/525 nm。

1.2.6RT-qPCR和Western blot法檢測各組細胞CerS2、p27的表達 感染48 h后采用Trizol分別提取各組細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用SYBR GreenⅠ熒光染料RT-qPCR二步法檢測CerS2 mRNA表達水平，以β-actin基因作為內參，用2-△△CT值表示基因相對表達量。所用引物β-actin上游：5′ -TTG CGT TAC ACC CTT TCT T-3′，下游：5′ -GTC ACC TTC ACC GTT CCA-3′；CerS2上游：5′-ATC GTC TTC GCC ATT GTT-3′，下游：5′-CGG TCA CTG CGT TCA TCT-3′；p27 kip1上游：5′-GGC TAA CTC TGA GGA CAC-3′,下游：5′-TTC TTC TGT TCT GTT GGC-3′。采用全蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，取蛋白30～50 μg行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉移至PVDF膜、封閉、一抗(分別為anti-CerS2 antibody、anti-p27 kip1 antibody)4 ℃孵育過夜、洗膜，二抗室溫孵育1～2 h，洗膜并顯色成像，比較條帶灰度值與灰度比。

1.2.7流式細胞術PI法檢測各組細胞周期的改變 腺病毒轉染48 h后，收集、調整細胞濃度約1×106個/mL，70%冷乙醇500 μL、4 ℃下固定2 h，100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

2 結 果

2.1CerS2目的基因擴增的PCR產物及重組穿梭質粒pDC315-CerS2-GFP的鑒定 將PCR擴增得到的產物回收、經EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切后取2 μL電泳鑒定，所得到的片段大小約為1 142 bp左右，與目的片段cDNA大小一致。重組穿梭質粒pDC315-CerS2-GFP測序結果顯示，所克隆片段與NM_18746序列CDS區完全一致(圖1)。病毒滴度為1.0×109PFU/mL。

圖1 Lass2重組腺病毒測序結果(僅展示部分)

2.2Cers2亞細胞定位 激光掃描共聚焦結果顯示，在細胞核周圍呈現藍、綠色重疊，少量分布在細胞質內，見圖2。

圖2 CerS2在HepG2肝癌細胞中的表達(亞細胞定位)

2.3各組HepG2肝癌細胞GerS2表達水平比較 對照組、空載組CerS2表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；感染48 h的實驗組比對照組CerS2 mRNA相對表達量增加了129.79倍(P<0.01)，蛋白表達水平也明顯增加(P<0.01)，見圖3。

2.4各組細胞周期的變化 流式細胞儀PI法結果顯示，與對照組、空載組比較，實驗組細胞G0/G1期百分比明顯增加，G2/M、S期百分比均明顯減少(P<0.01)，見表1、圖4。

a:P<0.05，與實驗組比較

圖3各組HepG2肝癌細胞CerS2表達水平比較

圖4 各組細胞周期分析結果

表1 各組細胞周期百分比比較

a:P<0.01,與實驗組比較

2.5各組HepG2細胞p27 kip1表達水平比較 實驗組p27 kip1 mRNA表達水平較對照組、空載組明顯上調(P=0.026、0.019)，且p27 kip1蛋白表達水平也明顯高于對照組及空載組(P<0.01)，見圖5。

a:P<0.05，與實驗組比較

3 討 論

CerS2基因是在肝癌相關基因大規模功能篩選時發現的與腫瘤轉移相關的新基因，研究表明其含保守的TLC功能域和特定的HOX功能域，HOX作為序列特異性DNA結合轉錄調節因子，在調控基因轉錄方面有著非常重要的作用，其對神經酰胺的合成是必需的，早期研究發現HOX域與細胞周期調控密切關聯，通過細胞周期影響細胞生長[6]。此外，CerS2在結構上包含了一個看家基因的典型特征，這是該家族其它成員所沒有的，其在各類腫瘤中抗腫瘤的具體機制仍不清楚。

本研究應用Admax系統構建重組腺病毒表達載體，該包裝系統利用了重組酶系統(Cre-loxP和FLP-frt),操作簡單且重組效率高、獲得的病毒產率高、目的基因的表達水平高，采用的增強型綠色熒光強度較普通熒光強度提升且保留了熒光蛋白功能的同時能快速有效的對融合的目的基因進行報告。經酶切、測序鑒定,CerS2重組腺病毒構建成功，并在HepG2肝癌細胞中形成高效過表達，亞細胞定位結果提示CerS2融合蛋白在細胞核周圍表達，少量在細胞質。該重組腺病毒的構建為本課題進一步研究CerS2在腫瘤代謝中的作用及機制奠定了基礎。

幾乎所有腫瘤細胞的生物學特性都是由于細胞周期紊亂所導致的失控性生長，即腫瘤細胞的生長依賴于細胞周期的正常更替[11]。G1/S期是細胞周期的主要限制點，其中細胞在G1期完成必要的生長和物質準備，在S期完成其遺傳物質--染色體DNA的復制， G2期進行必要的檢查及修復，以確保DNA復制的準確性，然后在M期完成遺傳物質到子細胞中的均等分配，并使細胞一分為二，而G0期是指細胞處于阻滯的狀態，是脫離細胞周期、暫時停止分裂的一個階段。本研究中流式細胞儀分析細胞周期各時相的百分比結果顯示CerS2基因抑制了肝癌細胞的生長，使細胞大量處于G0/G1期，阻滯肝癌細胞HepG2進入下一階段的增殖及分裂。

為進一步探討其可能的作用機制，本實驗觀察了上調的CerS2對細胞周期調節蛋白p27表達的影響。p27蛋白是CIP/KIP家族成員之一，是細胞增殖一個主要的負調控因子，通過結合及調控各種細胞周期素(Cyclin)-細胞周期素依賴性激酶(CDK)包括Cyclin D(D1,D2,D3)-CDK4/CDK6、Cyclin E-CDK2復合物[11-12]，從而調控細胞進入G1期和S期[13]，其調控腫瘤細胞周期的同時能抑制腫瘤細胞的分裂，是負性調控細胞周期的蛋白[14]。p27被認為是人類多種腫瘤獨立的預后因子和未來可能的腫瘤治療靶點。有研究報道，CDK抑制結構域位于p27蛋白的N-末端部分，該結構域使細胞足以停滯于G0/G1期，但p27可能在不同的細胞與不同分子相互作用，在適當的時間到達適當的細胞內位置發揮其生物學活性，呈現出對細胞周期不同的調控[15]。本研究結果提示上調的CerS2基因促進p27蛋白表達增強,這可能是肝癌細胞HepG2細胞周期G0/G1期阻滯的可能機制之一，但其具體的分子生物學機制如過表達的CerS2是通過何細胞調控因子或信號調控網絡導致p27上調及p27通過抑制何種Cyclin-CDK復合物導致細胞周期的改變等等尚待后續深入研究。