人臍帶間充質干細胞治療POF大鼠可行性及其機制的實驗研究

張靈俐，王 婷，劉文慧，杜 靜，王 浩△

(1．廣東藥科大學附屬第一醫院婦產科，廣州 510310；2.廣東藥科大學公共衛生學院，廣州 510310)

女性卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)一直無十分有效的治療手段，但間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)的快速發展為治療POF開拓了新方向[1]。MSC主要來源為骨髓、脂肪和臍帶，骨髓MSC存在人來源水平極低、病毒感染率高、增殖分化潛能隨年齡增大下降等風險[2]。人臍帶MSC(hUCMSCs)取材方便，免疫原性低，對不同程度受損組織有修復作用，可作為目前理想種子源細胞[3]。國內外已有相關研究，但確證性實驗證據不足，且改善卵巢儲備、生育功能作用機制尚不清楚，臨床進展緩慢[4-5]。本實驗旨在觀察hUCMSCs治療環磷酰胺(CTX)建立POF模型大鼠的卵巢結構功能變化，驗證此種療法的可行性及其可能的治療機制，為hUCMSCs臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD雌性大鼠62只，體質量(200±11)g，購自廣東省醫學實驗動物中心。檢疫4 d合格后進入實驗，飼養溫度與濕度：20～26 ℃，40%～70%，10 h∶14 h晝夜間斷照明，自由進食飲水。CTX購自德國Barter Oncology Gmbh。血清檢測ELISA試劑盒購于南京建成生物。選擇預產期前1個月內母血檢測傳染性病毒陰性者足月分娩胎兒的臍帶作樣本，與產婦簽訂知情同意書。組織貼壁法分離培養源細胞，后續試驗均采用第5代hUCMSCs。

1.2方法

1.2.1大鼠POF模型建立 雌性SD大鼠(n=62)隨機數字表法分成陰性對照(A組，n=18)、模型對照(B組，n=22)和hUCMSCs移植組(C組，n=22)。參照文獻[6-7]實驗，避免一次性大劑量注射CTX大鼠有致死風險，劑量不足可致造模失敗，改進方案：B、C組第1天、第2～15天分別注射CTX 10.00、3.20 mg/mL(5 mL/kg，1次/天，腹腔注射)[8]。A組注射等體積滅菌水。B、C組建模成功后各取18只大鼠用于后期實驗。建模前及完成后1 d尾靜脈采血測卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)水平。建模完成后2 d尾靜脈移植生長良好的第5代hUCMSCs單細胞懸液1 mL(1×106/mL)至C組。A、B均注射等量滅菌水。移植后1、17 d分組取血和卵巢組織測量各項指標。

1.2.2觀察指標

1.2.2.1血清檢測指標 CTX建模前后檢測血清中E2和FSH水平綜合評估POF模型構建是否成功。hUCMSCs移植后1、17 d取3組大鼠每組6只，腹主動脈采血，ELISA檢測血清中FSH、黃體生成素(LH)、抑制素B(INHB)和抗苗勒管激素(AMH)，對比FSH/LH值。

1.2.2.2HE染色 hUCMSCs移植后1、17 d取大鼠(每組6只)卵巢HE染色切片觀察組織形態，計算卵巢中生長卵泡、閉鎖卵泡與黃體數。

1.2.2.3熒光標記原位雜交技術(FISH)檢測ALU基因表達 hUCMSCs移植后17 d用FISH檢測大鼠(每組6只)卵巢中是否表達人的特異性基因序列ALU，通過設計ALU特異性探針，如果陽性則代表卵巢中存在人的細胞，證明移植的hUCMSCs存在于大鼠卵巢，取乳腺癌組織為陽性對照。

1.2.2.4免疫組織化學(IHC)檢測天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3) 移植后17 d取大鼠卵巢組織切片，IHC染色法處理，顯微鏡下隨機選取3個200倍放大視野使用IPP6.0對含半胱氨酸的caspase-3信號進行光密度值半定量分析。組織學觀察正常情況下只在閉鎖卵泡的顆粒細胞和黃體中的黃體細胞和膜細胞陽性表達caspase-3信號，POF患者除了在前3種細胞中表達外，生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞中也呈陽性表達。

2 結 果

2.1各組大鼠血清E2、FSH水平比較 建模前1 d A、B、C 3組大鼠血清E2、FSH水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。建模后1 d，B、C組E2水平均低于A組，FSH水平均高于A組，差異均有統計意義(P<0.05)，而B、C組間E2、FSH水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

a：P<0.05，與A組比較

2.2各組大鼠卵巢儲備功能比較 3組大鼠移植后1、17 d，FSH/LH比值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。移植后1 d，B、C組INHB、AMH水平均低于A組(P<0.05)；B、C組間差異無統計學意義(P>0.05)。移植后17 d，C組相較B組INHB水平增加(P<0.05)，但仍低于A組(P<0.05)；AMH水平較B組增加，與A組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組大鼠卵巢組織HE染色結果比較 各組大鼠卵巢組織結構完好，可見各級卵泡及黃體。A組大鼠卵巢組織結構未見異常，閉鎖卵泡數量較少；B組大鼠較A組卵巢體積減小、生長卵泡減少、閉鎖卵泡增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠較B組生長卵泡增多、閉鎖卵泡減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組大鼠兩個時間點黃體數量均未見明顯變化(P>0.05)。各組大鼠移植后1、17 d卵巢組織HE染色結果，見圖1、表3。

2.4hUCMSCs移植后17 d卵巢中人ALU基因表達情況 DAPI染色陽性對照細胞核呈藍色，圖中被染成紅色的即為人ALU基因序列探針。取A組卵巢組織為陰性對照，觀察發現被染成藍色的細胞核，并無紅色斑點存在。移植hUCMSCs后1、17 d卵巢組織中均能觀察到被染成紅色的人ALU基因，且能在少量的顆粒細胞及卵子細胞中觀察到被染成紅色的人ALU基因，見圖2。

2.5各組大鼠caspase-3水平比較 光密度值半定量分析，移植后1、17 d caspase-3免疫組織化學結果均顯示C組信號表達量高于B組，B組信號表達量高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)。組織學觀察，發現caspase-3信號在A、C組中表達在閉鎖卵泡的顆粒細胞和黃體中的黃體細胞和膜細胞，生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞不表達；caspase-3信號在B組的閉鎖卵泡的顆粒細胞、黃體中的黃體細胞和膜細胞，以及生長卵泡和成熟卵泡的顆粒細胞中均表達，見圖3、表4。

圖1 3組大鼠移植后卵巢HE染色結果(HE，×40)

A：陽性對照；B：陰性對照；C：hUCMSCs移植1 d；D：hUCMSCs移植17 d

圖3 caspase-3信號在3組大鼠卵巢組織中表達情況(HE，×200)

表2 3組大鼠移植后卵巢儲備功能評價指標比較

a:P<0.05,與A組比較；b:P<0.05,與B組比較

表3 3組大鼠移植后卵泡計數比較

a:P<0.05,與A組比較；b:P<0.05,與B組比較

表4 caspase-3 IHC分析結果

a:P<0.05,與A組比較；b:P<0.05,與B組比較

3 討 論

MSC起源于中胚層，具有自我復制和多向分化潛能。近年來，大量研究表明，MSC具備機體損傷及免疫調節的功能，被廣泛地應用于心血管、血液和神經系統等多方面疾病的臨床前研究中。來源于新生兒組織(臍帶血)的多功能MSC是再生醫學中極有潛力的干細胞群體[9]，本研究結果表明，hUCMSCs移植治療后大鼠與未治療大鼠相比，顆粒細胞細胞核膜逐漸修復，核仁出現，內質網與線粒體少量存在，說明hUCMSCs對卵巢顆粒細胞有修復作用。同時，光密度值半定量分析法檢測到，C組治療后大鼠卵泡中caspase-3的信號表達低于B組，且在生長卵泡和成熟卵泡中檢測不到caspase-3信號，說明hUCMSCs可以減少生長卵泡凋亡。因此，本實驗為hUCMSCs治療POF提供了實驗室依據，運用hUCMSCs治療POF大鼠具有可行性，其可改善卵巢儲備功能。

CTX會造成顆粒細胞的損傷[10]，顆粒細胞是包繞在卵母細胞周圍的一層菱形或扁平細胞，在卵母細胞發育成熟過程中起信號傳導與營養支撐作用，對維持卵泡正常功能極為重要。研究發現B組大鼠顆粒細胞核溶解、核膜消失、線粒體空泡化，線粒體與內質網數量逐漸減少，對比hUCMSCs移植治療后大鼠，證明了hUCMSCs對卵巢顆粒細胞的修復作用。可以推測hUCMSCs是通過修復卵巢顆粒細胞、減少生長卵泡凋亡而達到修復受損卵巢的作用。人鼠之間存在較大種族差異，但人與人之間不存在此種隔閡，使用人胚胎來源的hUCMSCs來治療人類POF，臨床實施可行性大大提高[11]。

朱少芳[12]將hUCMSCs移植進POF小鼠體內，在卵巢中發現了供體來源的卵母細胞，小鼠生殖能力得到改善，認為MSC有向受損部位濃集并分化成卵母細胞進行卵巢修復的特性[13]。本研究用FISH檢測法觀察到卵巢間質、顆粒和卵子細胞中均存在少量人ALU基因，證明hUCMSCs在卵巢間質中有分布，且有少量分化成了顆粒和卵子細胞。這說明通過尾靜脈注射hUCMSCs可成功到達卵巢，與李彩霞等[14]發現BMSCs定向卵巢部位歸巢能力的結果一致，其且與BMSCs有相同特性，可改善大鼠生殖能力，論證了靜脈注射移植hUCMSCs的可行性。此外，靜脈注射創傷性遠小于卵巢原位注射，操作可行性高，也為hUCMSCs運用于臨床治療POF奠定了基礎。

本實驗選用FSH/LH、INHB、AMH 3個臨床上較優的評價指標[15]。結果發現POF大鼠移植hUCMSCs后17 d，血清中AMH、INHB水平均上升，足以說明hUCMSCs可以有效地改善卵巢儲備功能。這對改善臨床上POF患者不孕狀況，具有十分重要的意義。hUCMSCs治療POF有兩個可能的途徑：(1)通過修復顆粒細胞等功能型細胞來修復受損卵巢；(2)直接分化成卵巢內顆粒細胞和卵子細胞對卵巢進行修復。hUCMSCs在POF相關疾病中的研究成果大多局限于動物模型，實際應用于臨床仍需繼續探索。此外，POF產生機制尚不完全清楚，今后應開展更多、更全面的深入研究，為POF的治療提供一個新的可行途徑。