礁膜室內規模化人工育苗的研究

粟 文，謝恩義，孫立偉，王艷平，王 惠，徐日升

( 廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088 )

礁膜(Monostromanitidium)又名綠紫菜，屬綠藻門、石莼目、礁膜科、礁膜屬，是冬、春季大型海藻，為一層細胞組成的膜狀體，黏滑，基部細胞向下延伸出假根絲組成固著器，成熟時產生雌、雄配子，配子結合為合子，并生長發育成孢子體。孢子體小型，囊球狀，孢子囊成熟后可產生有4條鞭毛的游孢子[1]。研究發現，礁膜營養豐富，含有較高的蛋白質、碳水化合物及多種維生素和礦質元素，口感好，食用價值高，并具有藥用價值，有清熱化痰、利水解毒、軟堅散結的作用，常用于治療喉炎、咳嗽痰結、水腫等[2-4]；從中提取的硫酸多糖有抗凝血、抗氧化、降血脂和抗炎活性[5-6]，因此，礁膜是一種極具開發潛力的海洋食品、藥物和化妝品等資源。雖然國內對綠藻的開發利用呈現上升的趨勢，浙江等地已形成了一定規模的綠藻加工產業，但產量還遠遠不能滿足國內外的需求[7-8]。因此開展綠藻栽培種——礁膜的人工育苗技術的研究具有重要意義。

20世紀90年代，日本Kida[9]較早完成了礁膜的人工育苗與栽培技術，日本礁膜的產業化已經比較完善，栽培技術處于領先水平。隨后，國內陳昌生等[10-12]研究了生態因子對礁膜配子和合子的影響；Hua等[13]研究了寬礁膜(M.latissimum)的生活史；謝恩義等[14]對寬礁膜的基礎生物學及室內育苗與栽培進行了較全面的研究；李曉麗等[15]對北極礁膜(M.arcticum)進行了合子采苗、孢子囊培養和孢子采苗等人工育苗試驗。這些研究多側重于基礎研究，雖然有過人工育苗的嘗試，但均未達到規模化育苗的要求。要發展我國礁膜栽培業，首先需要建立室內人工育苗技術，筆者對廣東地區礁膜進行了配子放散、合子附著與培養等相關試驗，旨在建立一套我國礁膜室內人工大規模育苗技術。

1 材料與方法

1.1 種藻來源

礁膜種藻于2016年3月至4月下旬采自廣東湛江硇洲島附近海域的中高潮帶，藻體加冰低溫運輸帶回實驗室，用消毒海水(經砂濾及暗沉淀處理的自然海水煮沸消毒20 min，冷卻至常溫)清洗去除藻體表面的泥沙和雜藻。

1.2 成熟礁膜配子日放散規律

挑選藻體顏色為黃褐色，鏡檢邊緣有一圈成熟配子囊的種藻，吸干藻體表面水分，取1 g種藻放入培養皿中加入20 mL消毒海水(鹽度27)，置于有自然光的恒溫室內(24±0.5) ℃，連續觀察24 h，每隔2 h用移液槍取25 μL配子液移至載玻片上，根據蓋玻片與視野面積之比，求出蓋玻片下的視野數(即25 μL配子液的配子數量)，從而計算出 20 mL中配子放散量。每次觀察后同時清洗藻體并更換消毒海水。

1.3 合子附著

黑暗時間對合子附著的影響：設置8個直徑為6 cm培養皿，每個培養皿放入3塊2 cm×2 cm×1 mm PVC苗板，倒入相同量配子液，置于黑暗處連續培養16 h[12-13]，每隔2 h取出1個培養皿，顯微鏡下(10×10)觀察合子附著數，根據苗板面積與視野面積之比，計算出每塊苗板的合子附著總數，取均值。

不同附著基對合子附著的影響：將PVC塑料板、PET塑料板、纖維板、普通玻璃板和有機玻璃板5種不同材料2 cm×2 cm×1 mm的苗板分別放入5個直徑為6 cm培養皿，每個培養皿3塊相同材料苗板，置于黑暗處12 h后同上計算苗板合子附著總數。

1.4 合子培養中雜藻硅藻的清除

用內徑0.48 cm的鉆孔器取硅藻附著基本一致的苗板圓片，放入200 mL消毒海水中，二氧化鍺質量濃度梯度設置為0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、20、30、40 mg/L。顯微鏡下(10×10)觀察各圓片附著的硅藻數，計算出二氧化鍺對附著硅藻處理后的脫落率或增長率。

1.5 礁膜室內人工育苗試驗

配子放散：將清洗干凈的種藻均勻鋪于干凈通風處陰干10～16 h(種藻含水量50%～60%)，稱量0.9 kg放入40 L消毒海水中(鹽度27、溫度24 ℃)，充氣攪拌，用光照度為5×104～9×104lx的強光照射，約5 min后加入適量45 ℃蒸餾水[13]，約30 min后用篩絹過濾出種藻即得配子液。同上計算配子放散總量。

合子附著與培養：將200張PVC苗板浸入40 L配子液中，黑暗處理12 h，合子附于PVC苗板后(同上計算合子附著總數)分置于4個塑料水槽中培養，水容積180 L，每個月更換消毒海水1～2次。培養期間，每隔5 d測1次水溫、鹽度、光照和合子直徑，每次測量20個合子，取其平均值。

采集游孢子及培育：游孢子采苗使用的附著基為維尼綸繩(海區栽培多采用苗繩，直徑1 cm)。采游孢子時,將生長成熟孢子囊的PVC苗板移入消毒海水中，強光照射(5×104～9×104lx)，經攪拌待大量游孢子放出，水色變為淺綠色時，取出PVC苗板，放入維尼龍繩，浸泡、翻動，待游孢子附著后移至塑料水槽內培養，水容積180 L。

1.6 數據統計及分析

數據采用Excel 2007和SPSS 16.0軟件進行統計分析，結果以平均值±標準差表示，取P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結 果

2.1 成熟礁膜配子日放散規律

3月初即將成熟的礁膜，在室內適宜條件下暫養約4 d，藻體邊緣顏色由綠色變成黃褐色，配子囊迅速成熟。鏡檢可見在成熟的配子囊放散配子前，囊壁變成透明狀，極易吸水破裂，配子即從裂口噴射而出。8:00—12:00配子放散量較少，14:00配子放散量較多，18:00—2:00配子放散量基本不變，4:00和6:00出現一個放散小高峰期，且在4:00時候配子放散量最高(圖1)。礁膜24 h晝夜均能進行配子放散，因此室內規模化人工育苗時可在較為方便的任何時間段進行采苗。

圖1 礁膜配子的日放散規律

2.2 合子附著

黑暗時間對合子附著的影響見圖2。由圖2可知，黑暗2～16 h均有合子附著，但黑暗時間短(2～6 h)，合子附著密度低；隨著黑暗時間的延長合子附著密度迅速增加，黑暗第8 h，合子的附著數達到最高，為8.7×105個。黑暗時間繼續延長，合子附著數逐漸下降，到第14 h時苗板合子附著數僅約為第8 h的65%。t檢驗表明，黑暗8～12 h間合子附著數無顯著差異(P>0.05)。

圖2 黑暗時間對合子附著的影響

不同材料的苗板對合子附著的影響見圖3。由圖3可知，黑暗處理12 h，合子均能很好地附著于5種材料苗板上，合子附著數為3.4×105～3.8×105個。t檢驗表明，5種材料苗板之間的合子附著數不存在顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同材料的苗板對合子附著的影響

2.3 合子培養中硅藻的清除

二氧化鍺清除硅藻的效果見表1。隨著二氧化鍺質量濃度的增加和處理時間的延長，硅藻脫落呈現遞增趨勢。當二氧化鍺質量濃度大于0.5 mg/L時，對附生硅藻的脫落作用顯著；當二氧化鍺質量濃度達3 mg/L時，苗板圓片上附生的硅藻在第11 d全部脫落。處理后的苗板圓片移至消毒海水繼續培養20 d，鏡檢合子正常生長。

2.4 礁膜室內人工育苗

配子放散時可觀察到大量配子聚集在一起成云霧狀，海水變為淺綠色，配子放散總數達4×1010個，平均每克藻體放散配子量高達4.4×108個。合子的培養條件及生長見表2。礁膜合子培養時間自4月中旬至9月中旬，歷時約5個月。合子培養前期(4—6月)，水溫較低，生長較快，合子由5.2 μm增至39 μm，6月下旬，鏡檢合子內形成顆粒狀的游孢子，轉為孢子囊。7—8月水溫較高，孢子囊生長緩慢，9月上旬進行遮光處理，以促使孢子囊同步成熟。附著于維尼綸繩上的游孢子，培育15 d后可生長至長度為1 cm的礁膜幼苗。

表1 二氧化鍺去除硅藻的效果

表2 合子的培養條件及生長

3 討 論

礁膜室內人工育苗技術能有效解決大面積推廣所需礁膜種藻的問題，緩解種質退化，為礁膜的規模化人工育苗及栽培提供技術支撐。根據多次采集種藻進行配子放散試驗發現，在礁膜繁殖盛期3月下旬至4月下旬期間的大潮前后可采集到成熟度較好的種藻，用于生產性育苗。根據礁膜屬已有的人工育苗研究[13-15]以及試驗可知，對種藻進行室內陰干刺激處理10～16 h，在采配子過程中充氣攪拌、強光照射、改變海水溫度(±2～3 ℃為宜)和鹽度(±3～5為宜)能一定程度促使配子集中大量放散。

Kida[9]將附著板打孔穿繩后，采用懸掛式方法進行合子附著和培養。本試驗采用插槽式方法進行合子附著和培養，能極大提高育苗效率，且便于操作管理。規模化人工育苗建議選用經砂輪打磨過的PVC塑料板作為苗板，便于在5個月的合子、孢子囊培養期里在顯微鏡下隨時觀察記錄其生長情況，苗板不宜過大，建議規格為20 cm×10 cm×1 mm。礁膜配子具趨光性，進行合子附著黑暗處理能使合子較均勻附著于苗板上，且能增加配子結合成合子的幾率[16]，但初生合子抗逆性弱，長久得不到光照，生長會受抑制，甚至死亡。本研究采用PVC苗板作為附著基，黑暗8～12 h時合子附著效率最高，這與陳昌生[11]直接采用培養皿為附著基黑暗10 h合子附著率達到最大的試驗結果相接近。合子在轉為孢子囊前光照度不能長期低于900 lx，超過2～3 d合子會迅速死亡。培養過程中苗板上極易滋長藍藻、綠藻和硅藻等雜藻，雜藻大量生長，搶占、替代合子生態位點，或釋放孢子萌發成小苗而覆蓋合子[13]，進而導致合子死亡。用0.5～3 mg/L二氧化鍺處理11 d能有效去除合子培養過程中滋生的硅藻，藍藻和綠藻可采用干燥的方法抑制其著生，但無法徹底根除，且繁殖速度極快。合子、孢子囊的培養期有5個月，培育效果直接影響到礁膜人工育苗的成敗，因此亟待進一步從根本上解決雜藻生長引起的合子死亡的問題。

圖4 礁膜室內人工育苗a.種藻室內陰干10～16 h；b.種藻放入消毒過濾海水中，采用充氣攪拌、強光照射等方法促進配子放散；c.將種藻濾出后的配子液；d.將PVC苗板浸入配子液中；e.黑暗處理8～12 h，使雌、雄配子結合成合子附著于PVC苗板上；f.附有合子的PVC苗板；g.附于PVC苗板上的合子(10×10)；h.室內合子培養；i.孢子囊釋放游孢子(10×10)；j.培育15 d長度為1 cm的礁膜幼苗(4×10).