一株斑點(diǎn)叉尾源愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

2018-11-28 02:27:20黃小麗陳家榮

水產(chǎn)科學(xué) 2018年6期

樊威，賀揚(yáng)，黃小麗，王均，吳俊，蘇建，陳家榮，蔣鑫，王俊

( 1.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川內(nèi)江 641000； 2.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江 641000； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，四川成都 611130； 4.四川省水產(chǎn)局，四川成都 610000 )

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

主要試劑和藥品：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉[Oxoid公司(中國)]，DNA Marker、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒、2×Taq Master Mix[天根生化科技(北京)有限公司]；細(xì)菌生化微量鑒定管、氧化酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚、H2S、阿拉伯糖、衛(wèi)矛醇、V-P、DNase、藥敏紙片等(杭州微生物試劑有限公司)。

1.2 病癥觀察

1.3 病原菌的分離和培養(yǎng)

在無菌狀態(tài)下，對病魚肝、腎和脾進(jìn)行細(xì)菌分離，將其接種于LB瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個優(yōu)勢菌落進(jìn)行細(xì)菌的分離純化后，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)特征記錄并進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌的16S rRNA鑒定

將純化的細(xì)菌接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。收集菌體，按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，使用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。序列結(jié)果提交美國國立生物技術(shù)信息中心進(jìn)行序列比對，并運(yùn)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。鑒定的細(xì)菌置于-20 ℃保存。

1.5 微量生物化學(xué)鑒定

根據(jù)PCR鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[8]中的方法進(jìn)行細(xì)菌的二次鑒定。采用細(xì)菌生化微量鑒定管法系統(tǒng)測定分離菌株生化特性，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行葡萄糖、阿拉伯糖、吲哚、氧化酶、衛(wèi)矛醇、V-P反應(yīng)和精氨酸雙水解酶等生化試驗(yàn)。

1.6 動物回歸感染試驗(yàn)

1.7 藥敏試驗(yàn)

將純化的細(xì)菌接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。采用K-B紙片擴(kuò)散法[9]，在超凈工作臺中將200 μL試驗(yàn)菌液用滅菌涂布棒平鋪于LB瓊脂培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿蓋后置室溫干燥3～5 min，用鑷子將藥敏紙片貼于平板表面并適當(dāng)按壓，每個培養(yǎng)基表面貼5張各種藥敏試紙，4張均勻地貼在離培養(yǎng)皿邊緣15 mm處，一張位于中心。隨后將培養(yǎng)皿倒扣置于恒溫箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)16～18 h。測量抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片廠家推薦的抑菌范圍判斷結(jié)果。