梅花鹿源不動桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

李 娟周 浪王 研曾邦權(quán)段博芳李維芬段 綱常 華李國雄 代飛燕*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.云南省昆明市瀕危動植物收容拯救中心，昆明，651700；3.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，昆明，650201；4.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明，650224)

不動桿菌(Acinetobacterspp.)廣泛分布于自然界，在水、土壤、乳和健康動物皮膚、胃腸道、生殖道和呼吸道中都可存在，通常無致病性。近年來，從河蟹中分離不動桿菌[1]，死亡大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)[2]，異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[3]，馬屬(Equus)動物[4]，犬[5]，牛羊等反芻動物[6-8]，禽類[9-10]，草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]，流產(chǎn)胎豬[12]，86例患重癥監(jiān)護室(Intensive Care Unit，ICU)患者[13-15]等均較多研究和報道。由于現(xiàn)在養(yǎng)殖的集約化，條件氣候改變等各種應(yīng)激，病毒性疾病的侵襲造成的免疫力下降，飼養(yǎng)條件簡陋，養(yǎng)殖密度過大等均為不動桿菌病的迅速傳播創(chuàng)造了有利條件。

梅花鹿(Cervusnippon)是一種中型鹿，屬于真獸亞綱(Eutheria)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿屬，是中國國家Ⅰ級保護動物，列入世界自然保護聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)2015年《瀕危物種紅色名錄》ver 3.1——低危(LC)(https：//www.iucn.org/)。梅花鹿在野外的活動量非常大，免疫力較強，但是經(jīng)過馴化飼養(yǎng)的梅花鹿由于飼養(yǎng)條件較好，運動量減少等因素致使其機體素質(zhì)下降，更加容易造成細菌感染致病。一旦細菌感染，輕則影響動物生產(chǎn)，使得飼料回報率降低，重則造成大規(guī)模動物死亡，給養(yǎng)殖戶帶來重大經(jīng)濟損失。另外，在人工飼養(yǎng)方式下，抗生素的濫用也該引起重視。如果長期使用一種或幾種抗菌藥物來治療則容易造成細菌產(chǎn)生耐藥性，因此養(yǎng)殖場對細菌病進行治療時，需要先做藥敏試驗篩選出敏感藥物。根據(jù)抗生素使用原則，選擇幾種敏感的藥物，通過變換藥物或聯(lián)合使用來防止耐藥性的產(chǎn)生[16-17]。因此通過本實驗研究可準確診斷病原菌，篩選敏感藥物進行有效治療。

1 材料與方法

1.1 材料

云南保山某養(yǎng)殖場，自從2012年開始養(yǎng)殖梅花鹿，養(yǎng)殖規(guī)模約為350～500頭，飼養(yǎng)目的主要做藥用，外來引種擴繁，采用“自繁自養(yǎng)，全進全出”的飼養(yǎng)模式。無菌采集病死梅花鹿的有出血和實質(zhì)病變的心臟、肝臟、肺臟于無菌平皿中進行細菌分離。普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院的公共平臺實驗室配制提供，并經(jīng)檢驗合格。藥敏紙片、生化鑒定管都是在杭州天和微生物試劑有限公司購買。SPF小鼠，雌雄各一半，6周齡，體重20～25 g，在昆明醫(yī)學(xué)院SPF實驗動物中心購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)與鑒定

解剖后取出梅花鹿的心臟、肝臟、肺臟，用劃線接種法接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～24 h，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果再挑取單個典型菌落劃線接種于普通瓊脂平板37℃進行純化培養(yǎng)[5]。經(jīng)分離得到的純培養(yǎng)物用劃線接種法分別接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和10%綿羊血脫纖維瓊脂培養(yǎng)基(由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院配制并檢驗合格)上置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落形態(tài)及在各種培養(yǎng)基上的生長情況。

1.2.2 生化鑒定

用接種環(huán)挑選純化培養(yǎng)后的優(yōu)勢菌落接種于生化鑒定管中，接種完后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48 h，進行觀察，記錄結(jié)果。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

分離純化細菌后，抽提基因組DNA利用細菌16S rDNA通用引物擴增16S rDNA基因片段。以新鮮培養(yǎng)的菌液為模板，采用細菌16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系25 μL，預(yù)混DNA聚合酶12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。取PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)通用型DNA純化回收試劑盒說明書回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果提交到NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列比對，找到同源性最高的幾個序列，確定分離細菌屬，尋找同源性最高的細菌，下載該屬的序列，用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。并采用鄰接法(Neighbor Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參考菌株信息見表1。

表1 參考菌株信息

Tab.1 Reference strain information

1.2.4 動物試驗

用培養(yǎng)的菌液進行試驗動物腹腔注射，菌液濃度為2.5×108cfu/mL，具體方法為每株菌注射5只小白鼠，劑量為0.5 mL，對照組注射生理鹽水0.5 mL。

1.2.5 試驗動物解剖及細菌分離

試驗動物攻毒后觀察老鼠精神狀態(tài)和死亡情況，待老鼠死亡后，在紫外燈照射過的無菌解剖臺上，打開小鼠腹腔、胸腔，觀察各個臟器的病理變化，無菌采集小鼠心臟和肝臟進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2.6 致病菌的鑒定

將死亡試驗動物肝臟中分離出來的細菌進行革蘭氏染色鏡檢，對比原始病料中分離的細菌，最終確定是否是主要致病菌。

1.2.7 藥敏試驗

用高壓滅菌后的三角棒將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布于普通瓊脂平板上，貼上藥敏紙片，輕輕按壓，確保貼穩(wěn)，防止掉落和移動，使得藥敏紙片完全與培養(yǎng)基接觸，以免影響藥物擴散不均勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

從病料心臟、肝臟、肺臟分離的細菌在普通瓊脂平板上置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，生長菌落形態(tài)都為邊緣整齊，光滑，濕潤，乳白色，圓形菌落。將菌株劃線接種于伊紅美藍瓊脂固體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂固體培養(yǎng)基和綿羊鮮血固體瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上，結(jié)果該株菌在麥康凱培養(yǎng)基上都長出典型紅色菌落(圖1)，在伊紅美藍培養(yǎng)基上都長出紫黑色帶金屬光澤菌落(圖2)，在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象(圖3)。挑取典型菌落進行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡油鏡觀察，結(jié)果該株菌均為革蘭氏陰性菌，形態(tài)都為長桿狀或短桿狀菌落，多數(shù)散在(圖4)。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基Fig.1 McGonagall medium

圖2 伊紅美藍培養(yǎng)基Fig.2 Eosin-Methy blue agar medium

圖3 血瓊脂平板Fig.3 Blood agar plate

圖4 100×目鏡Fig.4 100×eyepiece

2.2 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)物的單個菌落于普通肉湯中，37℃條件下2000 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。分別接種于微量生化鑒定管中，37 ℃恒溫箱中水平靜置培養(yǎng)24～48 h，觀察結(jié)果并記錄(表2)。根據(jù)文獻[7-13]可初步鑒定為不動桿菌。

表2 生化鑒定結(jié)果

Tab.2 The results of biochemical identification

續(xù)表2

2.3 16S rDNA序列分析結(jié)果

16S rDNA 測序，將獲得的16S rDNA 基因序列與 GenBank中登錄細菌16S rDNA進行比對，表明該分離菌16S rDNA 基因序列與已發(fā)表不動桿菌的16S rDNA 基因同源性較高，達97 %以上，由圖5可知，目的基因片段大小為1500 bp，與理論值一致。證明該菌屬為不動桿菌，與生化試驗鑒定結(jié)果一致。將該分離株與參考菌株16S rDNA 序列進行比對分析，顯示該株為不動桿菌與新加坡分離株屬于同一分支，與中國和印度分離株親緣關(guān)系較近，而與美國分離株親緣關(guān)系較遠(圖6)。

圖5 16S rDNA的PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of 16S rDNA

圖6 MHLBDYN201710菌株系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of MHLBDYN201710 strain

圖7 MHLBDYN201710菌株親緣關(guān)系比對Fig.7 Phylogenetic relationship of MHLBDYN201710 strain

2.4 致病性實驗結(jié)果

將該株細菌的擴大培養(yǎng)物對實驗組的昆明小鼠進行腹腔注射，用菌液分別注射5只小鼠，注射量都為0.5 mL，而對照組的實驗小鼠分別進行腹腔注射無菌生理鹽水0.5 mL。結(jié)果顯示，實驗組小鼠死亡時間為24～48 h，48 h之后沒有死亡小鼠均存活下來；對照組小鼠全部存活。

2.5 實驗小鼠病理剖檢結(jié)果

將死亡后的實驗小鼠按常規(guī)方法進行病理剖解，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟、心臟、腸黏膜及其他內(nèi)臟器官嚴重出血，腸壁變薄、泛黃、鼓氣，輸卵管出血等病變。

2.6 目的菌株回收

死亡小鼠解剖后，取出小鼠肝臟，并進行細菌分離。在37℃恒溫箱中培養(yǎng)分離出的細菌，選擇單個菌落并進行革蘭氏染色。菌落形態(tài)與原始分離菌一致，為圓形光滑、灰白色、邊緣整齊的菌落；再經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢也發(fā)現(xiàn)與原分離菌的形態(tài)相同，它們都是長桿菌或短桿狀菌落，大部分呈分散狀，不易褪色。表明其為該病的主要病原菌。

2.7 藥敏試驗結(jié)果

該病例主要致病菌是不動桿菌，菌株對氧氟沙星、卡那霉素、恩諾沙星、阿米卡星、大觀霉素、頭孢舒巴坦、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、青霉素、頭孢拉定、阿奇霉素等大多數(shù)抗菌藥物均高度敏感(表2)。 藥敏試驗操作方法按2005年版CLSI/NCCLSM100-S15所述方法進行。

表3 藥敏試驗結(jié)果

Tab.3 The results of drug sensitive test

續(xù)表3

注：抑菌圈的直徑≥20 mm為極敏感，15～20 mm為高度敏感，10～14 mm為中度敏感，10 mm以下且>0為低度敏感，等于0則為不敏感

Note：Diaphragm diameter≥20 mm extremely sensitive，15-20 mm highly sensitive，10-14 mm moderately sensitive，diaphragm diameter<10 mm，diaphragm diameter>0，low sensitivity，=0 not sensitive

3 討論

通過以上實驗結(jié)果可以得出該梅花鹿養(yǎng)殖場本次發(fā)病的病原菌主要是不動桿菌，在實驗中從病死鹿的肝臟都分離得到了不動桿菌，生化鑒定結(jié)果也與《伯杰氏細菌鑒定手冊》一致[18]。從藥敏實驗可以看出，由于該場為原生態(tài)放養(yǎng)，可以看出分離得到的菌株耐藥性并不強。大部分的抗生素對于該菌的抑菌作用較為理想，對于本病的治療應(yīng)該選擇對菌株均比較敏感的抗生素，如頭孢唑林、氨芐西林、強力霉素進行治療方能達到較好的治療效果。另外，在使用抗生素的同時，還需要聯(lián)合使用加強免疫的輔助藥物，如加入多維進行飲水。

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該場在飼養(yǎng)動物時添加精料過多。由于大量的精料充滿胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)酸，大量的酸性食物進入腸道，造成胃腸道pH下降，致使腸道菌群失調(diào)。為了更好地預(yù)防類似細菌病的暴發(fā)，建議養(yǎng)殖場降低養(yǎng)殖密度，提高養(yǎng)殖環(huán)境條件；適當添加粗料，保證粗纖維的足量攝入。

也曾有文獻報道大熊貓感染不動桿菌后表現(xiàn)為呼吸道癥狀，隨后急性死亡[2]。可見隨著野生動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細菌性疾病的發(fā)生在各種人工養(yǎng)殖的野生動物身上也越來越常見。飼養(yǎng)者應(yīng)給與足夠重視。