環(huán)境因子對塔里木馬鹿種群遺傳多樣性的影響

塔依爾江·麥麥提塔吉古麗·吐熱甫布威海麗且姆·阿巴拜科日蘇比奴爾·艾力馬合木提·哈力克

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊，830046；2.庫爾勒市第六中學(xué)，庫爾勒，841000；3.新疆維吾爾醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，和田，848000)

塔里木馬鹿(Cervuselaphusyarkandensis)是中國馬鹿8個(gè)亞種中唯一高度適應(yīng)荒漠生境的特殊亞種，屬國家II級重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，又是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[1]。近年來，在人為因素和自然因素的雙重影響下，塔里木馬鹿適宜棲息地環(huán)境不斷喪失、退化和片段化，給處于瀕危狀態(tài)的野生塔里木馬鹿的生存帶來了嚴(yán)重的威脅。因此本文通過探討塔里木馬鹿遺傳多樣性與環(huán)境因子之間的關(guān)系，找出影響塔里木馬鹿種群遺傳多樣性的主導(dǎo)環(huán)境因子，為塔里木馬鹿的保護(hù)與管理提供科學(xué)性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用非損傷性取樣法，在新疆塔里木盆地設(shè)3個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行野生塔里木馬鹿樣本收集，分別為：沙雅種群14個(gè)個(gè)體糞便樣本，尉犁種群11個(gè)個(gè)體糞便樣本，且末種群8個(gè)個(gè)體糞便樣本和當(dāng)?shù)刈o(hù)林站提供的自然死亡的2頭馬鹿肌肉樣本，總共采集了35個(gè)個(gè)體樣本，采集時(shí)，在野生塔里木馬鹿經(jīng)常出現(xiàn)的區(qū)域內(nèi)沿其足跡尋找糞便，為了避免樣本的污染保證糞便樣本的新鮮程度，采集到的樣本分別放入到裝滿無水乙醇的50 mL離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃冰箱待用。為比較塔里木馬鹿和天山馬鹿兩種群的狀況，我們以小渠子、白石頭和寒氣溝3種群的天山馬鹿樣本數(shù)據(jù)為主進(jìn)行了研究，具體操作均參考了周璨林的采樣信息[2](圖1)。

PCR擴(kuò)增所用引物：上游引物：5′-GAA AAA CCA TCG TTG TCA TTC A-3′，下游引物：5′-GGA GGT TGG AG CTC TCC TTT T-3′[3]。

圖1 塔里木馬鹿和天山馬鹿采樣點(diǎn)顯示圖Fig.1 The sampling site diagram of Tarim red deer and Tianshan red deer 注：圖中三角形圖標(biāo)表示塔里木馬鹿采樣點(diǎn)，方形圖標(biāo)表示天山馬鹿采樣點(diǎn) Note：Triangle dot represents the sampling site of Tarim red deer；Square dot represents the sampling site of Tianshan red deer

1.2 方法

1.2.1 環(huán)境因子

為了進(jìn)行塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性研究，本文選用塔里木馬鹿分布區(qū)和天山馬鹿分布區(qū)近31年(1984～2014)的年均降水量、年均氣溫、年均日照、人口、年均耕地面積、年均畜牧數(shù)量、年均無霜期、經(jīng)度、緯度和海拔等總共10個(gè)因子作為環(huán)境因子(表1)。有關(guān)天山馬鹿經(jīng)緯度與海拔數(shù)據(jù)參考了周璨林的數(shù)據(jù)[2]，塔里木馬鹿經(jīng)緯度和海拔是采集樣本時(shí)收集到的(表2)，而相關(guān)氣象數(shù)據(jù)則向新疆維吾爾自治區(qū)氣象局信息中心索取。

表1 各地理種群環(huán)境數(shù)據(jù)

Tab.1 Each population environmental data

注：所有數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，Mean±SD

Note：All data were expressed in the form of mean±standard deviation(SD)

表2 馬鹿采樣點(diǎn)地理坐標(biāo)與海拔數(shù)據(jù)

Tab.2 Geographic coordinates and elevationdata of sampling plots of red deer

1.2.2 DNA提取

提取糞便DNA所用的試劑配制與提取方法參考日沙來提等人改良的CTAB裂解法進(jìn)行[4]，提取肌肉DNA參考趙建軍的方法[5]。

1.2.3 PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系為DNA模板(含DNA10～100 ng)4 μL，上游引物(10 μM)3 μL，下游引物(10 μM)3 μL，Primer Star Max DNA Polymerase 24 μL，ddH2O 19 μL。設(shè)計(jì)不加模板的空白對照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存。純化擴(kuò)增產(chǎn)物送至寶生(大連)生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序部進(jìn)行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

從表可以看出，P值均為0.25，大于顯著性水平0.05，卡方對應(yīng)的P值具有統(tǒng)計(jì)顯著性，通過顯著水平為95%的顯著性檢驗(yàn)。卡方與自由度之比為1.622，小于2。同時(shí)，GFI接近于1，RMSEA小于0.05，以上幾個(gè)指標(biāo)均滿足模型檢驗(yàn)與擬合優(yōu)度的要求，說明模型擬合效果較好。

序列結(jié)果首先用DNAStar 5.0軟件包中的Editseq和Seqman子程序進(jìn)行基因片段的合并。編輯后序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性比對，去除非同源的樣本，確認(rèn)擴(kuò)增片段是否我們所需要的目的片段。用Clustal W 1.83排序[6]，并手動(dòng)修改那些顯而易見的排序錯(cuò)誤。應(yīng)用DNASP 5.10軟件[7]計(jì)算各地理種群單倍型多樣性(Haplotype diversity，h)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)。應(yīng)用Arlequin 3.1軟件計(jì)算各個(gè)地理種群之間的基因流和遺傳分化程度[8]。本文有關(guān)天山馬鹿的種群遺傳多樣性數(shù)據(jù)參考周璨林的數(shù)據(jù)[2]。利用SPSS 19.0對塔里木馬鹿和天山馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子進(jìn)行多元逐步回歸分析。 應(yīng)用Canoco 4.5軟件對塔里木馬鹿和天山馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子之間分別進(jìn)行冗余(RDA)分析，進(jìn)一步探討塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 序列特征

目的片段的擴(kuò)增通過馬鹿mtDNA Cytb基因特異性引物來完成。擴(kuò)增長度為1140 bp的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶亮而清晰，沒有雜帶，與引物設(shè)計(jì)的擴(kuò)增條帶相符。因此，確定為目的條帶，可以進(jìn)行測序。測序所得的塔里木馬鹿Cytb基因1140 bp序列中，各堿基的平均含量分別為29.3%(T)、27.3%(C)、13.4%(G)、30.1%(A)，A+T的含量為(59.4%)，C+G的含量為 40.6%，A和T的比例高于C和G的比例，A+T的含量明顯高于C+G的含量，堿基含量顯示出一定的偏歧性(表3)。各密碼子位點(diǎn)堿基含量不均勻，第一位各堿基含量在27%(T)和17%(G)之間，第二密碼子位點(diǎn)12%(G)和32%(T)之間，第三密碼子位點(diǎn)33%(A)和12%(G)之間，密碼子三位點(diǎn)G的含量最低而A的含量最高。野生塔里木馬鹿Cytb基因序列中G堿基相對缺乏。

表3 塔里木馬鹿Cyt b基因堿基組成

Tab.3 The Tarim red deer Cyt b gene composition

2.2 種群遺傳多樣性

塔里木馬鹿3個(gè)地理種群的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)為：沙雅種群0.911～0.016，尉犁種群0.664～0.008，且末種群0.363～0.005，其中遺傳多樣性相對較高的是沙雅種群，相對較低的是且末種群(表4)。塔里木馬鹿種群總體具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，整體遺傳多樣性不平衡，處于較低水平。

2.3 基因流

應(yīng)用Arlequin 3.1軟件計(jì)算各個(gè)地理種群之間的基因流(Nm)和遺傳分化程度(FST)，結(jié)果顯示各地理種群之間具有顯著的遺傳分化現(xiàn)象。塔里木馬鹿3個(gè)地理種群(表5)中尉犁種群與且末種群之間Nm=0.724，尉犁種群與沙雅種群之間Nm=5.562，且末與沙雅種群之間Nm=0.910，尉犁種群與沙雅種群之間的基因流值Nm大于4，說明兩個(gè)種群之間有一定程度的基因交流，是個(gè)隨機(jī)交配的群體。且末種群與沙雅種群、尉犁種群之間的基因流值Nm均小于1，說明且末種群與其他兩個(gè)種群之間的基因交流缺乏，分化程度顯著。

表4 塔里木馬鹿3個(gè)地理種群的遺傳多樣性

Tab.4 The three population genetic diversity of Tarim red deer

表5 塔里木馬鹿的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)

Tab.5 Population parameters for Tarim red deer

注：a：P>0.05，無顯著差異；b：P<0.01，有極顯著差異；上方為遺傳分化值，下方為基因流值

Note：a：P>0.05，Not significant；b：P<0.01，Statistical significant；above diagonal is the value of genetic differentiation，and below is the gene flow value(Nm)

2.4 環(huán)境因子對塔里木馬鹿種群遺傳變異的影響

將馬鹿種群內(nèi)遺傳多樣性和各地區(qū)經(jīng)度、緯度、海拔、年均降水量、年均氣溫、年均日照、人口、年均耕地面積、年均畜牧數(shù)量和年均無霜期10個(gè)因子作為環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析。

通過SPSS 19.0軟件的結(jié)果可以看出(表6)基于線粒體DNA Cytb基因的塔里木馬鹿和天山馬鹿核苷酸多樣性(π)與年均降水量、海拔和緯度呈正相關(guān)，其中與年均降水量(r=0.783，P<0.05)和海拔(r=0.997，P<0.05)呈顯著的正相關(guān)，與緯度(r=0.414，P>0.05)呈無顯著的正相關(guān)；與年均無霜期、年均氣溫、年均日照、經(jīng)度、人口、年均畜牧數(shù)量和年均耕地面積呈負(fù)相關(guān)，其中與年均無霜期(r=-0.341，P>0.05)、年均日照(r=-0.263，P>0.05)和經(jīng)度(r=-0.065，P>0.05)呈無顯著的負(fù)相關(guān)，與年均氣溫(r=-0.619，P<0.05)、年均畜牧數(shù)量(r=-0.537，P<0.05)和年均耕地面積(r=-0.534，P<0.05)呈顯著的負(fù)相關(guān)，與人口呈極顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P<0.01)；單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)的相關(guān)性均與年均降水量、海拔和緯度呈正相關(guān)以外剩下的因子都呈負(fù)相關(guān)。

表6 塔里木馬鹿和天山馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性

Tab.6 Crolation coefficent between genetic diversity and environment factors

注：h：單倍型多樣性；π：核苷酸多樣性；*：0.01

Note：h：haplotype diversity；π：nucleotide diversity；*：0.01

Canoco 4.5軟件的結(jié)果來看(圖2)，塔里木馬鹿線粒體DNA Cytb的核苷酸多樣性指標(biāo)(π)的箭頭與表示年均氣溫(QW)、緯度(WD)、海拔(HB)和年均降水量(JSH)箭頭方向相同，表明這4個(gè)環(huán)境因子與核苷酸多樣性呈正相關(guān)；人口(RK)、年均日照(RZH)、年均畜牧數(shù)量(XM)、年均耕地面積(GD)、經(jīng)度(JD)和年均無霜期(WSH)的箭頭與塔里木馬鹿核苷酸多樣性指標(biāo)(π)的箭頭方向相反，表明以上因子與核苷酸多樣性呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)箭頭的長短可知環(huán)境因子對塔里木馬鹿遺傳多樣性的相關(guān)程度。其中年均氣溫(QW)和人口(RK)與塔里木馬鹿遺傳多樣性的相關(guān)性最高；經(jīng)度(JD)與塔里木馬鹿遺傳多樣性的相關(guān)性最低。

Canoco 4.5軟件的結(jié)果來看(圖2)，天山馬鹿線粒體DNA Cytb的核苷酸多樣性指標(biāo)(π)的箭頭與年均降水量(JSH)、海拔(HB)、緯度(WD)和年均無霜期(WSH)的箭頭方向相同，表明這4個(gè)環(huán)境因子與核苷酸多樣性呈正相關(guān)；與年均氣溫(QW)、人口(RK)、年均畜牧數(shù)量(XM)、年均耕地面積(GD)、年均日照(RZH)和經(jīng)度(JD)的箭頭方向相反，表明以上因子與核苷酸多樣性呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)箭頭的長短可知與海拔(HB)和年均降水量(JSH)相關(guān)性最大；與經(jīng)度(JD)相關(guān)性最低。

蒙特卡洛里檢驗(yàn)的結(jié)果來看，顯著影響天山馬鹿遺傳多樣性的環(huán)境因子分別為海拔(r=0.883，F(xiàn)=7.36，P=0.031)、年均降水量(r=0.789，F(xiàn)=7.44，P=0.045)、年均氣溫(r=-0.517，F(xiàn)=5.86，P=0.047)和人口(r=-0.780，F(xiàn)=7.821，P=0.048)，因此這些環(huán)境因子是影響天山馬鹿遺傳多樣性的主要環(huán)境因子。

圖2 塔里木馬鹿(左)和天山馬鹿(右)種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的RDA分析圖Fig.2 The RDA analysis between the Tarim red deer andTianshan red deer genetic diversity and environmental 注：圖中紅色箭頭表示環(huán)境因子年均降水量(JSH)、年均氣溫(QW)、年均日照(RZH)、年均無霜期(WSH)、海拔(HB)、經(jīng)度(JD)、緯度(WD)、人口(RK)、年均畜牧數(shù)量(XM)和年均耕地面積(GD)；藍(lán)色箭頭表示遺傳多樣性參數(shù)核苷酸多樣性(P)、單倍型多樣性(h) Note：The red arrow represents the environmental factor，annual precipitation(JSH)，annual temperature(QW)，annual sunshine(RZH)，annual frost free period(WSH)，altitude(HB)，longitude(JD)，latitude(WD)，population(RK)，average annual animals(XM)and annual cultivated area(GD).Blue arrows represents genetic diversity parameters，nucleotide diversity(P)and haplotype diversity(h)

3 討論

3.1 塔里木馬鹿種群遺傳多樣性

計(jì)算種群的單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)是準(zhǔn)確評價(jià)種群遺傳多樣性的重要參數(shù)。馬合木提等[9]通過微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記來分析野生塔里木馬鹿的遺傳多樣性，結(jié)果表明塔里木馬鹿種群的遺傳多樣性低于北美馬鹿的遺傳多樣性，種群可能正受到近親繁殖的威脅；董曉宇等[10]基于mtDNA D-Loop區(qū)的野生塔里木馬鹿種群遺傳多樣性的研究，結(jié)果表明各地理種群的遺傳多樣性較低，處于不平衡狀態(tài)。本研究基于mtDNA Cytb基因的野生塔里木馬鹿種群遺傳多樣性的結(jié)果來看，具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，整體遺傳多樣性還是不平衡，處于較低的水平，這與董曉宇等的結(jié)果相一致。種群基因流分析，與董曉宇等的結(jié)果比較也有明顯的提高，其中且末種群與其他兩個(gè)種群之間的基因交往有所頻繁，這在一定程度上表明了較為獨(dú)立的且末種群遺傳多樣性趨向于恢復(fù)狀態(tài)。另一方面表現(xiàn)出我國政府對塔里木河流域生態(tài)環(huán)境綜合治理的有效性，于2000年到2009年進(jìn)行的塔里木河下游9次應(yīng)急輸水工程成功實(shí)現(xiàn)臺特瑪湖接近30年干枯的環(huán)境重新得到滋潤[11]。尉犁種群與且末種群之間形成的約320 km的綠色走廊隨著塔里木河下游綜合治理工程的推動(dòng)下慢慢恢復(fù)，兩個(gè)種群開始基因交流的表現(xiàn)。

3.2 環(huán)境因子對馬鹿種群遺傳多樣的影響

分析環(huán)境因子對遺傳結(jié)構(gòu)的影響，可以進(jìn)一步了解生存在特定生態(tài)環(huán)境中的生物對特定環(huán)境的反應(yīng)機(jī)制[12-13]。

從本研究的結(jié)果可知，塔里木馬鹿和天山馬鹿種群遺傳多樣性與海拔、年均降水量和緯度呈正相關(guān)性，其中與海拔和年均降水量呈顯著的正相關(guān)；與年均氣溫和采樣點(diǎn)人口呈顯著的負(fù)相關(guān)，說明海拔是影響塔里木馬鹿和天山馬鹿種群遺傳多樣性的主要環(huán)境因素，這與劉艷華等[14]的結(jié)果相一致。隨著緯度和海拔的升高馬鹿種群遺傳多樣均表現(xiàn)出增加的趨向。這可能是海拔因素引起的氣候變化的結(jié)果，隨著海拔和緯度的升高，相對氣溫和氣壓下降，濕度升高[15]。各種氣候因子發(fā)生的劇烈變化，對塔里木馬鹿和天山馬鹿的生存會產(chǎn)生影響，導(dǎo)致馬鹿遺傳結(jié)構(gòu)上的變化。還有可能與馬鹿的起源有關(guān)，鹿類是天生生活在山地森林地區(qū)的動(dòng)物[16]，因此可能喜歡或更適應(yīng)于濕度高，氣溫低的環(huán)境。采樣點(diǎn)人口數(shù)量與馬鹿種群遺傳多樣性呈顯著的負(fù)相關(guān)性。雖然很多時(shí)候人類活動(dòng)不能直接影響動(dòng)物遺傳多樣性，但是以人為主題的各項(xiàng)活動(dòng)會間接地影響動(dòng)物的遺傳多樣性。1984年到2014年當(dāng)中馬鹿棲息地環(huán)境隨著人口的增多、大量的開墾耕地和畜牧業(yè)的發(fā)展等人類活動(dòng)的頻繁，導(dǎo)致了馬鹿水資源的短缺和棲息地面積的減少以及片段化，片段化程度的加重會形成馬鹿種群獨(dú)立化，高度獨(dú)立的種群內(nèi)會發(fā)生近親交配和遺傳票變現(xiàn)象，進(jìn)一步導(dǎo)致遺傳多樣性降低。

對馬鹿這種警惕性特別強(qiáng)的動(dòng)物來說，人類活動(dòng)的影響是必然會有的[17]。蘇化龍等的研究結(jié)果表明人為因素是影響有蹄類動(dòng)物生存的關(guān)鍵因子[18]；Hartl 等的研究結(jié)果表明人類活動(dòng)在一定程度上影響馬鹿種群的遺傳多樣性[19]，本研究的結(jié)果支持蘇化龍等 和Hartl等的結(jié)果。

3.3 環(huán)境因子對塔里木馬鹿種群遺傳多樣的影響

塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的RDA分析結(jié)果顯示(圖2)，塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與年均氣溫、人口和年均降水量呈顯著的相關(guān)性，其中與年均氣溫呈顯著的正相關(guān)。隨著溫度適當(dāng)上升，塔里木馬鹿種群遺傳多樣性均表現(xiàn)出增高的現(xiàn)象。原因可能是野生塔里木馬鹿的被毛不多，對低溫比較敏感，而且適當(dāng)?shù)臏囟茸兓欣隈R鹿體內(nèi)的酶活性，從而影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響表現(xiàn)型。塔里木馬鹿在冬季以積雪作為重要的水資源，隨著氣溫升高雪融化隨之加快，這為塔里木馬鹿提供水資源[20]。塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與年均降水量呈顯著的正相關(guān)，這表明適應(yīng)于干旱環(huán)境的塔里木馬鹿隨著降水量的增加，可能食物也增多，這對塔里木馬鹿種群遺傳多樣性有利[15]。塔里木馬鹿種群遺傳多樣性與采樣點(diǎn)人口呈顯著的負(fù)相關(guān)，塔里木河中下游大面積墾荒，在馬鹿棲息地除了馬鹿以外的畜牧數(shù)量的增加尤其是人類活動(dòng)的頻繁，很大程度地影響塔里木馬鹿的生存。本研究所選擇的年度塔里木馬鹿分布區(qū)域內(nèi)畜牧數(shù)量、耕地面積、人類活動(dòng)不斷增加導(dǎo)致遺傳多樣性的下降。雖然人為因素不能直接影響馬鹿遺傳多樣性的變化，但是它造成的各類后果必然會直接影響馬鹿種群數(shù)量。這與艾尼瓦爾等[21]研究結(jié)果相一致。

天山馬鹿種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的RDA分析可知(圖2)，天山馬鹿種群遺傳多樣性與海拔和年均降水量呈顯著的正相關(guān)；與年均氣溫和人口呈顯著的負(fù)相關(guān)。此與塔里木馬鹿的結(jié)果相反，這可能與馬鹿生存環(huán)境有關(guān)。天山馬鹿主要分布于高海拔、雨水較多的區(qū)域，因此這種特殊的環(huán)境使馬鹿具備適應(yīng)這種環(huán)境的能力而繼續(xù)生存。同樣塔里木馬鹿適應(yīng)于半干旱少雨環(huán)境中，因此出現(xiàn)了馬鹿對同一個(gè)環(huán)境因子的反應(yīng)有所不同的現(xiàn)象。隨著海拔和緯度的升高，相對氣溫和氣壓下降，濕度升高，隨著海拔的升高天山馬鹿種群遺傳多樣性均趨向于增高，因此年均降水量和氣溫與天山馬鹿種群遺傳多樣性呈顯著的正相關(guān)。與人口呈顯著的負(fù)相關(guān)，天山馬鹿的采樣點(diǎn)(小渠子、白石頭、寒氣溝)基本上是風(fēng)景優(yōu)美的旅游景點(diǎn)區(qū)附近，所以人類活動(dòng)是影響天山馬鹿遺傳多樣性的因素之一[22]。

無論是塔里木馬鹿還是天山馬鹿，影響馬鹿種群遺傳多樣性的環(huán)境因子基本相同。但是年均氣溫與塔里木馬鹿種群遺傳多樣性呈正相關(guān)，而與天山馬鹿種群遺傳多樣性呈顯著的負(fù)相關(guān)，這說明馬鹿不同生境中受不同的環(huán)境因子的影響。這結(jié)果與郝崗平等[23]的研究結(jié)果相一致。可能原因是自然選擇可以導(dǎo)致不同生境生存的物種遺傳多樣性的影響模式不同，即選擇壓力對不同區(qū)域的作用也不同[24]。