MEF2A基因第11外顯子多態性與頸動脈斑塊易損性的關聯分析

王鳳 金笑平 王恩 王皖芬 鄭周 胡曉飛 何欣威 胡彩虹 應忠明

急性腦梗死占腦卒中的60%～80%[1]，其重要發病機制是在大動脈粥樣硬化的基礎上，頸動脈粥樣易損斑塊突然破損、血小板激活和血栓形成。目前關于頸動脈易損斑塊形成機制的研究已深入到分子和基因水平[2-3]。肌細胞增強因子2A（MEF2A）在血管平滑肌中高度表達，并對細胞的存活或凋亡起著關鍵作用[4]。相關研究發現MEF2A基因多態性與缺血性心臟病、心力衰竭、精神分裂癥等多種疾病的發生、發展相關[5-7]。MEF2A基因多態性可引起轉錄異常，進而影響血管內皮細胞的功能，血管內皮發育不正常或缺陷會導致炎癥和粥樣斑塊形成，繼發血栓、心肌梗死和猝死[7]。MEF2A的第11外顯子存在多個多種基因多態性位點，包括短串聯重復序列 rs376557691 的（CAG）n（1257-1290）、DNA片段長度多態性rs759657998的CCG缺失（1291-1293）、單核甘酸多態性 rs367780642（1299A/G）等。Han 等[8]發現MEF2A基因第11外顯子的CAG重復序列多態性與中國人冠心病有關，當CAG重復序列數為9時，是冠心病的一個獨立預測因子。Xu等[9]研究發現MEF2A基因第11外顯子1671-1677的“CAGCCG缺失”與一個包含34例家系的早發性冠心病/心肌梗死相關。目前關于MEF2A基因多態性的研究集中在其與冠狀動脈粥樣硬化及心肌梗死的關系上，但與發病機制如頸動脈易損斑塊的關系尚未見報道。基于MEF2A基因存在多個多態性位點，筆者探討了MEF2A基因第11外顯子多個多態性位點與頸動脈易損斑塊的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 連續收集2007年1月至2016年12月浙江省臺州醫院收治的無血緣關系且首次診斷為腦梗死的患者660例，所有患者符合缺血性腦卒中診治指南中關于急性腦缺血性卒中的診斷標準[1]，且頭顱MRI或CT血管成像提示顱內未見動脈粥樣硬化斑塊。根據頸動脈超聲檢查結果，將頸動脈有低回聲斑塊和混合性回聲斑塊的患者納入易損斑塊組（205例），頸動脈有高回聲斑塊的患者納入穩定斑塊組（455例）[10]。排除標準：合并惡性腫瘤或自身免疫性疾病；合并血液病或嚴重肝腎疾病；合并心房纖顫、心力衰竭、瓣膜病、心肌病、心內膜炎、附壁血栓或急性冠脈綜合征；合并妊娠或甲狀腺疾病；合并嚴重外傷史或感染性疾病；溶栓患者；最近3個月服用過降脂藥及抗血小板藥物。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 人血液基因組DNA提取試劑盒、DNA聚合酶、PCR Master Mix反應液等購自中國上海捷瑞生物工程公司；特異性引物由中國上海捷瑞生物工程公司合成；DNA基因測序由中國上海生工生物工程公司完成。

1.2.2 標本采集 抽取清晨空腹肘靜脈血2ml于加有抗凝劑的試管，分裝至1.5ml EP管。使用人血液基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書進行DNA抽提。提取好的DNA標本儲存于-80°C冰箱。

1.2.3 頸動脈超聲檢查 由超聲科高年資醫師專人操作。舒張末期測量頸總動脈分叉處近端1cm、頸總動脈分叉處以及頸內動脈起始段1cm后壁的內中膜厚度，雙側各測量3次，取其平均值。

1.2.4 PCR檢測 （1）利用PCR從基因組DNA中特異性擴增MEF2A基因第11外顯子。外顯子引物由上海基康生物有限公司合成。U：TCAGTGCTGGAGGGCAGTTA，L：CAATTGGAGAATGGAAGTCGC。（2）反應體系：10×緩沖液2.5μl，Mg2+1.0μ（l25mol/L），Mix dNTP 0.5μl（10mmol/L），上、下游引物各0.5μ（l20μmol/L），TaqDNA聚合酶 0.25μl（5U/μl），DNA 模版 1.0μl，雙蒸水加至25μl。（3）反應條件：94°C 預變性 5min；94°C 變性 45s，54°C 退火 45s，72°C 延伸 1min，循環 35 次；最后 72°延伸10min。（4）凝膠電泳：取5μl PCR擴增產物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳，經溴化乙錠染色，用凝膠成像分析儀分析PCR產物特性。（5）序列分析：對瓊脂糖凝膠中目的DNA片段進行切膠回收純化，純化DNA寄往上海生工生物工程公司進行DNA序列測定。

1.3 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件。用基因計數法計算兩組患者的基因型及等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子數+雜合子數）（/2×受檢人群）。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。Hardy-Weinberg平衡分析：rs367780642及rs759657998位點基因型及等位基因分布采用χ2檢驗，rs376557691的（CAG）n基因分布采用SHEsis軟件分析，P＞0.05為符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結果

2.1 兩組患者一般特征比較 頸動脈易損斑塊組與穩定斑塊組患者的性別、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、LDL、糖尿病史比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而年齡、Fb、TG、TC、HDL、高血壓病史、吸煙史、飲酒史比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般特征比較

2.2 MEF2A基因測序結果 rs367780642位點檢測到GG基因型和GA基因型，兩組患者基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）；rs759657998位點檢測到CCG/CCG基因型和-/CCG基因型，兩組患者基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。易損斑塊組與穩定斑塊組rs367780642位點的GG、GA基因型頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；等位基因G、A頻率比較，差異亦無統計學意義（P＞0.05）；易損斑塊組與穩定斑塊組rs759657998位點的CCG/CCG、-/CCG基因型頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；等位基因CCG、CCG缺失頻率比較，差異亦無統計學意義（P＞0.05），見表2。部分樣本MEF2A基因第11外顯子的測序結果，見圖1。

圖1 部分樣本MEF2A基因第11外顯子的測序結果[a：（CAG）9純合子，可見9個CAG重復序列；b：（CAG）10純合子；c：（CAG）11純合子；d：（CAG）9與（CAG）10的雜合子；e：rs759657998其中1條DNA鏈的1個CCG缺失，致后面堿基CCA序列前移，從而出現CCG+CCA重疊（箭頭所示）；f：rs367780642位點存在GG基因型和GA基因型（箭頭所示）]

表2 兩組患者MEF2A基因各位點基因型及等位基因頻率比較[例（%）]

2.3 CAG重復單元的單個等位基因分布 rs376557691的CAG重復單元的數目不等，部分樣本測序結果見圖1。（CAG）n主要集中在9～11個，采用SHEsis軟件進行Hardy-Weinberg平衡分析，兩組患者CAG基因均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。除（CAG）9～11外，其他CAG重復單元的等位基因比例均＜5%，見表3。因此，參考Han等[8]統計學方法，將所發現的等位基因分成 4 類，即（CAG）9、（CAG）10、（CAG）11 和其他 CAG 重復，結果發現兩組患者CAG重復單元的分布差異無統計學意義（P＞0.05），見表 4。

表3 CAG重復單元的單個等位基因比例[例（%）]

表4 兩組患者MEF2A基因rs376557691位點的CAG等位基因頻率比較[例（%）]

3 討論

MEF2屬轉錄調節因子，可以調節細胞的增殖、分化和凋亡，其家族成員在脊柱動物中包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。MEF2A在血管平滑肌細胞增殖及內皮細胞發育、功能和結構維持中起著重要的調控作用[7]。研究發現，MEF2A可通過激活p38MAPK信號依賴途徑刺激血管平滑肌細胞和巨噬細胞的單核細胞趨化蛋白1表達，從而介導血管炎癥反應[11]。MEF2A還可通過與miR-143相互作用調節過氧化氫誘導的血管平滑肌的凋亡[12]。此外，MEF2A基因顯性負突變和RNA沉默，可以通過p38MAPK信號通路誘導血管平滑肌表型轉化，導致細胞增殖和遷移明顯增加[13]。而平滑肌細胞的增殖與凋亡通過參與纖維帽變薄、細胞外基質減少、細胞碎片聚集和內膜炎癥反應，從而影響粥樣硬化易損斑塊的形成。

MEF2A基因的遺傳變異導致MEF2A蛋白構象的改變，不僅會影響MEF2A在細胞核內的定位，也會減弱由MEF2A介導的轉錄激活[7]。MEF2A第11外顯子具有多個多種基因多態性位點，由于研究對象、研究方法及統計學方法等差異，研究結果各有不同。戴大鵬等[14]通過PCR及PCR產物直接測序技術法研究MEF2A基因的CAG三聯核苷酸重復序列與北京人群冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的關系，發現（CAG）n與冠心病的發生有關。Hsu等[15]通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術分析中國臺灣258例冠心病患者及258例對照者的MEF2A基因，結果發現MEF2A第11外顯子（CAG）n等位基因在冠心病組與對照組中的分布比較差異無統計學意義。Lieb等[16]主要通過PCR及單鏈構象多態性檢測白種人MEF2A基因第11外顯子（CAG）n及內含子1、8、9等多個位點多態性，發現心肌梗死患者與對照組多態性位點分布比較差異無統計學意義。Han等[8]主要通過PCR及單鏈構象多態性檢測分析漢族冠心病患者，發現冠心病組（CAG）9的等位基因頻率高于對照組，推測CAG重復的多態性可能影響了轉錄水平的傳統剪接，繼而在翻譯過程中形成了不同的異構體和截短蛋白，導致在核定位、DNA結合、配體結合、二聚化等過程中的競爭性抑制。Dai等[17]在1例早發冠心病的家系中發現，3/5的成員檢測出rs759657998（-/CCG）位點存在CCG缺失突變，認為單倍型1291-1293 CCG缺失+1305G+1353T與早發冠心病明顯相關。Liu等[18]在一項病例對照研究中通過基因測序方法分析rs367780642和rs759657998位點在冠心病患者與對照組中的差異，結果提示兩組患者2個位點差異無統計學意義。

本研究選擇了MEF2A基因中目前研究最多且存在多種基因多態性的第11外顯子其中一段300bp左右的DNA片段進行測序分析，該段外顯子包含了基因多態性最常見的DNA重復序列多態性rs376557691的（CAG）n（1257-1290）、單核苷酸多態性rs367780642（1299A/G）、DNA片段長度多態性rs759657998的CCG缺失（1291-1293）。與國內外研究結果基本一致的是：本研究rs376557691位點的（CAG）n主要集中在9～11個，為編碼谷氨酰胺的重復。因其他（CAG）n的單個等位基因比例均＜5%，筆者參照了Han等[8]統計學方法，將（CAG）9、（CAG）10、（CAG）11 和其他 CAG 重復進行比較，兩組間等位基因分布差異無統計學意義。本組研究對象被發現在rs759657998（-/CCG）位點中存在CCG缺失，rs367780642位點存在A/G多態性；此外，易損斑塊組與穩定斑塊組rs759657998（-/CCG）和rs367780642位點的基因型及等位基因頻率比較，差異均無統計學意義，提示兩者與漢族人易損斑塊形成無關，且排除其他混雜因素影響后差異仍無統計學意義。

綜上所述，MEF2A基因第11外顯子（CAG）n的等位基因分布可能與漢族人群急性大動脈粥樣硬化性頸動脈易損斑塊的易患性無關，且rs367780642位點A/G多態性及rs759657998的CCG缺失與漢族人群急性大動脈粥樣硬化性頸動脈易損斑塊亦無關。但本研究對象較為局限，且僅對該外顯子中一段300bp左右的DNA片段進行測序分析，在種族和MEF2A基因第11外顯子其他復雜的基因多態性及功能上有待進一步研究。