LAIR1基因3’端非翻譯區(qū)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風險的關(guān)系研究

林輝 徐丹萍 諸溢揚 鄭路亞

在我國，胃癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的前三位，且有明顯的地域差異。胃癌發(fā)病年齡集中在50歲以上人群，且男女發(fā)病率明顯失衡。人白細胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體 1（leukocyte-associated Ig-like receptor 1，LAIR1）幾乎表達于所有免疫細胞，包括NK細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、單核細胞衍生樹突狀細胞、嗜酸細胞、嗜堿細胞及肥大細胞等[1]。LAIR1的細胞質(zhì)尾有2個ITIM基序，體外研究表明LAIR1通過單克隆抗體與分子間的交聯(lián)反應(yīng)，使細胞質(zhì)尾的ITIM基序的酪氨酸磷酸化，再招募SHP-1、SHP-2和Csk發(fā)揮免疫抑制功能[2]。查詢國外千人項目基因組測序數(shù)據(jù)庫（IGSR）發(fā)現(xiàn)，中國西雙版納傣族與北京漢族人種LAIR1基因3’非翻譯區(qū)（3’UTR）單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點基因型分布頻率存在明顯差異。而本研究對胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點基因分布頻率進行分析，以探討其與胃癌發(fā)病風險的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年10月至2015年9月在本院經(jīng)胃鏡下組織活檢確診的121例胃癌患者為胃癌組，其中男 91 例，女 30 例；年齡 30～87[64（57，71）]歲；腫瘤類型：鱗癌1例，腺癌95例，印戒細胞癌4例，腺癌+印戒細胞癌20例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例。121例患者中92例接受胃癌根治術(shù)，明確腫瘤分化程度：中高分化41例，低分化51例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期58例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率為36.5%。選取同期本院收治且年齡、性別與胃癌患者匹配的126例慢性胃炎患者為對照組，均接受過胃鏡檢查，胃鏡下可見橢圓形、圓形潰瘍或糜爛，組織活檢結(jié)果為慢性胃炎；其中男94例，女32例；年齡 35～75[60（51，65）]歲。在 IGSR 查詢到傣族、北京漢族和南方漢族人種LAIR1基因3’UTR的SNP位點詳細信息，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過。

表1 LAIR1基因3’UTR的6個SNP位點詳細信息

1.2 一代測序法檢測LAIR1基因3’UTR序列 取乙二胺四乙酸抗凝血，按照血液DNA抽提試劑盒操作說明書（GK1072，100T，上海捷瑞生物工程有限公司）對外周血全基因組DNA進行抽提。在保守區(qū)域設(shè)置引物，采用正向引物LAIR1F-5′-CCCACAGTCCACAAAGCCCAT-3′，反向引物 LAIR1R-5′-TGAGATTCTGCCGCCTCCTAGT-3′對 LAIR1 基因的 3’UTR 的 （19∶5355287-54355435）進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物片段長度為1 212bp，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行確認。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化，同時在中間段設(shè)置測序引物 LAIR1M-5′-TGCGTGGAGTAAAGCACAACCC-3′，采用一代測序儀（Applied Biosystems）進行正向及中段測序。

1.3 序列比對 通過dbSNP數(shù)據(jù)庫在19號染色體5355287-54355435位（LAIR1基因3’UTR）可查詢到267個SNP位點，兩組患者的測序結(jié)果采用序列比對工具BLAST進行比對，發(fā)現(xiàn)主要存在6個SNP位點，見表1和圖1。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。胃癌組與對照組患者基因型及等位基因分布頻率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，并計算OR值及其95%CI來評估胃癌患者的相對風險。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 LAIR1基因3’UTR的6個SNP位點的測序圖

2 結(jié)果

2.1 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性檢測結(jié)果 兩組患者LAIR1基因3’UTR的 6個SNP位點基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌組患者rs199714928位點G/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于對照組，G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表 2～3。胃癌組 rs1054033 與 rs6509867 位點均存在完全單倍型連鎖現(xiàn)象，而對照組有16例存在不完全單倍型連鎖現(xiàn)象（P＜0.05），見表4。

2.2 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性與胃癌分化程度的關(guān)系 不同胃癌分化程度患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性位點基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者，等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表5～6。不同性別、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點基因分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表2 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個SNP位點基因型分布頻率比較[例（%）]

表3 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個SNP位點等位基因分布頻率比較[例（%）]

表4 兩組患者LAIR1基因3'UTR區(qū)rs1054033與rs6509867等位基因連鎖比較[例（%）]

3 討論

LAIR1早在1997年就被克隆，同時發(fā)現(xiàn)它被DX26抗體識別與結(jié)合后可抑制NK細胞的細胞毒功能[3-5]。LAIR1是由287個氨基酸序列組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含了獨特的膜外C2型Ig樣區(qū)域和細胞質(zhì)尾的2個ITIM基序[1,6]。根據(jù)分化抗原簇，LAIR1又被命名為CD305，在結(jié)構(gòu)上與其他定位在染色體19q13.4上的淋巴細胞受體復合物的抑制性Ig超家族成員相似。研究發(fā)現(xiàn)，LAIR1基因參與抑制粒細胞-單核細胞刺激因子（GM-CSF）誘導急性髓系白血病細胞增殖，與膠原蛋白結(jié)合后強烈抑制GM-CSF介導的細胞內(nèi)鈣增加、磷酸化、AKT1/PKBα活化[7]。LAIR1基因的功能性配體是膠原蛋白，當羥脯氨酸存在時具有高親和性。體外研究發(fā)現(xiàn)，不管是細胞系還是原發(fā)細胞中的膠原蛋白，與LAIR1基因結(jié)合均能直接抑制免疫細胞的生物學活性[8]。LAIR1基因廣泛表達且其周圍存在大量配體，因此必須調(diào)節(jié)LAIR1基因/膠原蛋白的相互反應(yīng)，從而確保免疫系統(tǒng)的平衡。一方面，作用于細胞的活化信號強度由LAIR1基因/膠原蛋白的交聯(lián)反應(yīng)來決定信號是否被抑制；另一方面，LAIR1基因表達水平?jīng)Q定其與膠原蛋白反應(yīng)的抑制水平。

表5 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個SNP位點基因型分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系

表6 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個SNP位點等位基因分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系

目前關(guān)于LAIR1基因與實體瘤的關(guān)系研究較少。已有研究表明腫瘤患者血清可溶性LAIR1基因表達高于正常人，且外周血中NK細胞、CD4+及CD8+T細胞表面LAIR1基因表達明顯增加[9]。研究表明，宮頸癌組織及上皮卵巢癌組織LAIR1蛋白表達均高于正常癌旁組織，且與腫瘤大小、病理分期、臨床分級和淋巴結(jié)陽性數(shù)有關(guān)[10-11]。將LAIR1基因轉(zhuǎn)染到不表達LAIR1基因的Me-180細胞并使其穩(wěn)定表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過度表達LAIR1蛋白會抑制細胞的增殖能力和抗凋亡能力[10]。然而，對表達LAIR1基因的HO-8910細胞進行基因敲除并使其基因表達沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力及細胞侵襲能力反而增強[11]。

本研究對胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs199714928位點G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于慢性胃炎患者；但在中國西雙版納傣族人種（93例）中發(fā)現(xiàn)此位點全為純化子（G/G），與此位點祖先等位基因G一致，這表明rs199714928位點部分G突變成A可能是生物進化的原因，以保護機體抵抗胃癌的發(fā)生。同時還發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs1054033與rs6509867位點均存在完全的C-G和T-T單倍型連鎖現(xiàn)象，而慢性胃炎患者存在16例突破該連鎖現(xiàn)象的T-G單倍型。可見，rs1054033與rs6509867位點出現(xiàn)T-G單倍型是一種保護機體抵抗胃癌發(fā)生的現(xiàn)象。進一步分析發(fā)現(xiàn)，胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者，等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者；而不同性別、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點基因分布頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，LAIR1基因3’UTR的rs199714928位點多態(tài)性可能是胃癌發(fā)生的易感因素；rs1054033與rs6509867位點存在不完全單倍型連鎖（T-G單倍型）可能是一種保護機體抵抗胃癌發(fā)生的有利因素。