白三烯受體拮抗劑對自身免疫性神經(jīng)炎大鼠IL－17表達的影響

谷明明，金 善

格林－巴利綜合征 （Guillain－Barne syndrome，GBS）是嚴重影響人類身體健康的一種常見的自身免疫性疾病，是自身免疫性神經(jīng)肌肉麻痹的主要原因［1］。到目前為止，GBS的治療主要以對癥支持治療和免疫治療為主。免疫治療為血漿置換或靜脈注射丙種球蛋白［2］，現(xiàn)已證實，血漿置換療法（PE）和靜脈注射大劑量免疫球蛋白對GBS有效，但血漿置換療法對該病的預(yù)后并沒有明顯幫助，仍有3%～10%的患者死亡，高達20%的患者沒有完全恢復(fù)健康，伴有不同程度的后遺癥，常出現(xiàn)過敏反應(yīng)、繼發(fā)性心腦血管疾病等［3］。另外，由于該療法治療費用較高，大部分患者難以接受。根據(jù)白三烯受體拮抗劑（CysLTs受體拮抗劑）對免疫系統(tǒng)的體內(nèi)外作用研究推測，CysLTs受體拮抗劑可以影響細胞免疫反應(yīng)，有望成為自身免疫性疾病治療的新方法［4］。該研究應(yīng)用CysLTs受體拮抗劑（普魯司特）分別干預(yù)免疫期間、發(fā)病階段的實驗性自身免疫性神經(jīng)炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）模型大鼠，觀察普魯司特對模型大鼠的臨床評分、病理變化以及免疫指標的影響，評價CysLTs受體拮抗劑對EAN模型大鼠的作用，從而進一步探討其可能的免疫機制，為自身免疫性疾病的治療尋找一種質(zhì)優(yōu)價廉、安全、有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Lewis大鼠40只，雌性，7～8周齡，體質(zhì)量150～170 g（實驗動物許可證編號為SCXK（京）2012－0001）。

1.2 儀器與試藥P0180－199（SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS）多肽購自安徽瀚海博興生物技術(shù)有限公司；不完全弗氏佐劑（Incomplete Freund's Adjuvant，IFA）購自美國Sigma公司；結(jié)核桿菌（H37Ra）購自美國Difco公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與Taq DNA酶（美國Fermenats公司）；引物（上海生工技術(shù)有限公司）；大鼠抗兔一抗免疫組化試劑盒購自英國Abd Serotec Co.Oxford公司。抗大鼠二抗PV－6002試劑盒購自北京中杉金橋。普魯司特、甲潑尼龍琥珀酸鈉。AE200電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；勻漿機 （中國上海醫(yī)療器械廠）；Thermo ELECTRON CORPORATION離心機 （型號：HEAREUS FRESCO 17 Centrifuge）； 生物組織攤片烤片機（CS－Ⅲ 湖北省醫(yī)用電子儀器廠制造）；病理圖像分析（CX41－32rfl OLYMPUS）；日本電子JEM－1200EX透射電鏡；美國GATAN CCD圖像處理系統(tǒng)；PCR 擴增儀（ABI 7300）；7300 System SDS Software。

1.3方 法

1.3.1 EAN模型的建立 Lewis大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)（SPF級）1 W后，隨機分為4組：普魯司特A組、普魯司特B組、甲潑尼龍琥珀酸鈉組以及正常對照組，每組各10只Lewis大鼠。10%水合氯醛（300 mg/kg） 腹腔注射麻醉。 將 200 μgP0180－199、1 mg 結(jié)核桿菌、100 μl生理鹽水和100 μl不完全弗氏佐劑混合液充分乳化，作為1只大鼠的注射用量，注入大鼠雙側(cè)后肢足墊皮下（每只足底100 μl）。普魯司特A組：于免疫前第1天，到免疫后第8天，每日給予普魯司特3 mg/kg皮下注射；普魯司特B組：于免疫后第5天，到免疫后第16天，每日給予普魯司特3 mg/kg皮下注射；甲潑尼龍琥珀酸鈉組：于免疫前第1天，到免疫后第8天，每日給予甲潑尼龍琥珀酸鈉1 mg/kg，皮下注射；空白對照組：取相同體積的生理鹽水每日皮下注射。免疫當天記為0天，于免疫前1天及免疫后每日進行臨床評分，直至免疫后第16天。

1.3.2 臨床評分 每天記錄大鼠體重、臨床行為學(xué)評分。評分標準：正常：0分；尾巴拖地或尾尖上翹：1分；翻正反射受損：2分；中度癱瘓：3分；重度癱瘓：4分；四肢癱瘓或死亡：5分［5］。癥狀介于中間時評分值±0.5分。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查 于EAN大鼠疾病高峰期（免疫后第16天）處死大鼠，取其坐骨神經(jīng)近脊髓段并固定于10%中性福爾馬林中，石蠟包埋，4 μm縱行切片。HE染色，觀察大鼠坐骨神經(jīng)中浸潤的炎性細胞。

1.3.4 免疫組化檢查IL－17陽性細胞表達 免疫后第16天從大鼠坐骨神經(jīng)根部取約1 cm長神經(jīng)做免疫組化。石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加一抗（兔抗大鼠和二抗（辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體），DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。觀察大鼠坐骨神經(jīng)中細胞陽性表達，結(jié)果以細胞數(shù)/mm2組織表示。

1.3.5 RT－PCR法檢測脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中IL－17mRNA的表達 免疫后第16天處死大鼠，取脾臟、淋巴結(jié)和坐骨神經(jīng)，分成約100 mg小塊置EP管中，編號置液氮中保存。RT－PCR檢測IL－17 mRNA的表達：引物序列見表1。按試劑說明書要求抽提總RNA并測定其濃度。RT反應(yīng)按Tirozl試劑盒說明書提取RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cD NA。PCR擴增：（1）反應(yīng)體系及條件：①IL－1 與 β－actin：10 mmol/L dNTP 1 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，10×Taq Buffer with（NH4）2SO42.5 μl，50 μmol/L IL－17 上、下游引物各 0.75 μl，1 U/μl Taq 酶 1.25 μl，cDNA 3 μl，去離子雙蒸水 13.25 μl，總體積25 μl。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸 45 s， 共 40循環(huán)，72℃終末延伸 10 min。將 PCR擴增產(chǎn)物在7300 System SDS Software掃描分析，檢測脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中IL－17mRNA的表達。

表 1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，在符合正態(tài)分布及方差齊同的條件下，四組間均數(shù)以單因素方差分析進行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臨床癱瘓評分與空白對照組相比，普魯司特A組、普魯司特B組發(fā)病時間明顯延遲，高峰期評分明顯降低（P＜0.05）；普魯司特A組較普魯司特B組發(fā)病時間晚，高峰期評分低（P＜0.05）。甲潑尼龍琥珀酸鈉組與對照組癱瘓評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表 2 各組大鼠臨床癱瘓評分比較（±s）

表 2 各組大鼠臨床癱瘓評分比較（±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與普魯司特B組比較，＃P＜0.05。

分組 n 發(fā)病時間（d） 高峰期評分（分）普魯司特A組 10 12.01±0.37＊＃ 1.18±0.11＊＃普魯司特B組 10 10.56±0.77＊ 1.62±0.32＊甲潑尼龍琥珀酸鈉組 10 8.38±1.02 2.39±0.40空白對照組 10 8.36±1.03 2.41±0.41

2.2 大鼠坐骨神經(jīng)炎性細胞比較與空白對照組相比，普魯司特A組、普魯司特B組炎性細胞浸潤數(shù)目顯著減少（P＜0.05）；普魯司特A組較普魯司特B組炎性細胞浸潤數(shù)目明顯減少（P＜0.05）。甲潑尼龍琥珀酸鈉組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表 3，圖 1。

表 3 大鼠坐骨神經(jīng)炎性細胞比較（±s）

表 3 大鼠坐骨神經(jīng)炎性細胞比較（±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與普魯司特B組比較，＃P＜0.05。

組別 n 炎性細胞浸潤數(shù)目（個/mm2）普魯司特 A 組 10 36.80±3.66＊＃普魯司特B組 10 52.36±10.11＊甲潑尼龍琥珀酸鈉組 10 122.02±35.05空白對照組 10 129.02±34.05

圖 1 大鼠坐骨神經(jīng)炎性細胞浸潤（HE，×400）

2.3 坐骨神經(jīng)IL-17陽性細胞表達比較與空白對照組相比，普魯司特A組、普魯司特B組IL－17陽性細胞表達顯著降低（P＜0.05）；普魯司特A組較普魯司特B組IL－17陽性細胞數(shù)目亦降低明顯（P＜0.05）。甲潑尼龍琥珀酸鈉組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4，圖2。

表 4 坐骨神經(jīng)IL-17陽性細胞表達比較（±s）

表 4 坐骨神經(jīng)IL-17陽性細胞表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與普魯司特 B 組比較，＃P＜0.05。

組別 n IL－17陽性細胞數(shù)目（個/mm2）普魯司特 A 組 10 19.88±8.02＊＃普魯司特B組 10 36.97±10.98＊甲潑尼龍琥珀酸鈉組 10 85.22±17.55空白對照組 10 87.02±16.45

圖 2 大鼠坐骨神經(jīng)IL-17陽性細胞表達（DAB，×400）

2.4 IL-17mRNA在脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中的表達比較與空白對照組相比，普魯司特A組、普魯司特B組IL－17mRNA在脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中的表達顯著降低（P＜0.05）；普魯司特A組較普魯司特B組IL－17mRNA在脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中的表達亦降低明顯（P＜0.05）。甲潑尼龍琥珀酸鈉組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5，圖3。

表 5 IL-17mRNA在各組脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中的表達（±s）

表 5 IL-17mRNA在各組脾臟、淋巴結(jié)、坐骨神經(jīng)中的表達（±s）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與普魯司特 B 組比較，＃P＜0.05。

組別 脾臟 淋巴結(jié) 坐骨神經(jīng)普魯司特 A 組 0.251±0.075＊＃ 0.285±0.039＊＃ 0.199±0.038＊＃普魯司特 B 組 0.431±0.097＊ 0.452±0.067＊ 0.325±0.061＊甲潑尼龍琥珀酸鈉組 0.708±0.121 0.781±0.101 0.542±0.077空白對照組 0.731±0.144 0.801±0.118 0.577±0.098

圖 3 IL-17mRNA在大鼠脾臟、淋巴結(jié)和坐骨神經(jīng)中的表達

3 討論

我國每10萬人中就有4～15人罹患格林－巴利綜合征（GBS）［6］，每個年齡段都可發(fā)病，其中以學(xué)齡前及學(xué)齡期兒童居多。格林－巴利綜合征具有獨特的臨床及病理特征，雖然病因目前仍未明確，但其發(fā)病機制可能涉及體液免疫與細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，病理特點為周圍神經(jīng)、神經(jīng)根的節(jié)段性髓鞘脫失和外周神經(jīng)的小血管周圍淋巴細胞以及巨噬細胞的炎性反應(yīng)。格林－巴利綜合征通常由感染誘發(fā)，約2/3的患者發(fā)病前有胃腸道或呼吸道感染史［7］，遺傳和環(huán)境因素及個人的敏感性亦參與了疾病的發(fā)生。

Adams與Waksaman用完全弗氏佐劑（CFA）的混合液，對嚙齒類動物進行免疫，從而獲得了EAN的動物模型，EAN無論從神經(jīng)電生理還是臨床病理都與格林－巴利綜合征有著驚人的相似，是自身免疫性T細胞和巨噬細胞及相關(guān)細胞因子介導(dǎo)的周圍神經(jīng)脫髓鞘病變。GBS患病大鼠是研究GBS的經(jīng)典動物模型［8，9］。 該研究使用 P0180－199誘導(dǎo) Lewis 雌性大鼠成功造模，采用六級評分法作為評分標準［10］。大鼠免疫第1天開始出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，包括皮毛不潔、精神萎靡、雙后足紅腫、體重下降等表現(xiàn)，與GBS發(fā)病前的病毒感染前驅(qū)癥狀相似，考慮與免疫原引起全身免疫反應(yīng)有關(guān)；免疫第7天時大鼠均出現(xiàn)尾巴拖地行為，行為學(xué)評分1分，提示造模成功。

EAN的發(fā)病機制是針對神經(jīng)髓鞘或軸索中組織成分的自身免疫反應(yīng)，T細胞、單核－巨噬細胞共同參與了該過程，細胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶也是疾病效應(yīng)階段的關(guān)鍵參與因素。活化的巨噬細胞通過直接吞噬作用或分泌炎性介質(zhì)引起髓鞘脫失，而自身免疫性抗體可通過細胞毒性、激活補體或生物電阻斷作用使上述炎性反應(yīng)進一步加劇［11］。一直以來Th1細胞被認為是EAN的主要致病細胞，但近期研究發(fā)現(xiàn)表型特征獨特和分泌IL－17的Th17細胞亞群逐漸為人所認識。曾認為以Th1細胞反應(yīng)為主的自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)是Th17或Th17/Th1細胞反應(yīng)類型。IL－17是Th17細胞分泌的關(guān)鍵性因子之一，具有強促炎癥作用，可誘導(dǎo)上皮細胞、內(nèi)皮細胞或成纖維細胞的分泌，從而產(chǎn)生許多炎癥介質(zhì)，如 GM－CSF、IL－6和 PGE2等。同時，IL－17對TNF－α可產(chǎn)生協(xié)同作用，促進一系列黏附分子的表達，增強T細胞的活化，與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［12］。CysLTs受體拮抗劑，因其抑制分泌IL－17，并且抑制淋巴細胞增殖，所以對哮喘模型動物的臨床癥狀起到緩解作用［13］。筆者認為，CysLTs受體拮抗劑可以影響細胞免疫反應(yīng)，有望成為自身免疫性疾病治療的新方法。

該研究應(yīng)用CysLTs受體拮抗劑普魯司特分別干預(yù)免疫階段、發(fā)病階段的EAN大鼠，觀察普魯司特對模型大鼠的病理變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：普魯司特可減輕EAN病情，減少坐骨神經(jīng)中炎性細胞浸潤，降低坐骨神經(jīng)促炎性因子的表達，降低IL－17mRNA的表達。

綜上所述，CysLTs受體拮抗劑－普魯斯特應(yīng)用于免疫性神經(jīng)炎的經(jīng)典動物模型，可以明顯減輕動物模型的免疫神經(jīng)炎的癥狀，提示普魯司特對EAN有一定治療作用，且價格易于接受，沒有其他不良反應(yīng)，有希望應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。