自擬板柴口服液質量標準改善的研究＊

郝 哲，張建幫，李曉明，王麗軍，劉 棟，程艷芹，李明春

［作者單位］450042河南鄭州，原解放軍153醫院制劑室（郝哲，張建幫，李曉明，王麗軍，劉棟）；266071山東青島，原解放軍401醫院制劑室（程艷芹，李明春）

板柴口服液來源于筆者所在醫院臨床經驗方，由板藍根、柴胡、金銀花、大青葉和魚腥草組成，具有清熱解毒、疏散風熱、利咽消腫的功效，用于感冒發熱、咽喉腫痛等癥。板藍根是傳統的抗病毒中藥之一，作為方中主藥，很好地發揮了其清熱解毒的功效。現代藥理研究表明，板藍根中的（R，S）－告依春有明顯的抗流感病毒作用［1］，是板藍根抗病毒的代表性有效成分之一，也是反映板藍根藥材質量的一個重要指標［2］。原標準僅采用薄層色譜法對板藍根和柴胡進行定性鑒別，標準相對滯后，為進一步有效控制該制劑的內在質量，該實驗優化了薄層色譜條件，對板藍根、大青葉和柴胡3種藥材進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法對該制劑中R，S－告依春進行含量測定，該次研究擬為軍隊醫院制劑質量標準提升邁入一個新臺階提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC－10A高效液相色譜儀；BT－125D型電子天平（賽多利斯有限公司）；KQ－50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥柴胡皂苷a對照品 （批號110777－201108，含量為90.5%）；靛玉紅對照品 （批號110717－200204）；R，S－ 告 依 春 對 照 品 （ 批 號111753－201304，含量為 99.9%）；柴胡對照藥材（批號 120992－201108）； 大青葉對照 藥 材 （批 號121367－200602）； 板藍根對照藥材 （批號121177－201306），均購于中國食品藥品檢定研究院。板柴口服液 （中國人民解放軍第一五三中心醫院自制，批號：150312，150327，150506）；陰性樣品自制；甲醇為色譜純（天津四友），水為自制蒸餾水，其他試劑均為分析純。硅膠G薄層板（上海海洋化工有限公司）。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 柴胡的 TLC 鑒別［3－5］取本品 10 ml，加水20 ml，用水飽和的正丁醇萃取2次，30 ml/次，合并正丁醇液，用氨試液30 ml洗滌1次，取正丁醇層，蒸干，殘渣加乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。另取不含柴胡的陰性樣品10 ml，同法制成陰性對照溶液。再取柴胡皂苷a對照品適量，加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。再取柴胡對照藥材 0.2 g，加乙醇 5 ml，超聲 10 min，濾過，作為柴胡對照藥材溶液。照薄層色譜法《中國藥典》四部通則0502（2015年版）吸取供試品溶液和陰性對照溶液各 10 μl，對照品溶液及對照藥材溶液各 5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－乙醇－水（8∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的紅色斑點，陰性對照無干擾。結果見圖1。

圖 1 柴胡的薄層鑒別圖

2.1.2 板藍根、 大青葉的TLC鑒別［6－9］取本品30 ml，用二氯甲烷萃取2次，30 ml/次，合并二氯甲烷液，用1%NaOH溶液洗滌2次，20 ml/次，取二氯甲烷層，濃縮至約1 ml，作為供試品溶液。另取不含板藍根、大青葉的陰性樣品30 ml，同法制成陰性對照溶液。再取大青葉對照藥材0.2 g，加二氯甲烷5 ml，超聲20 min，濾過，即得大青葉對照藥材溶液；再取板藍根對照藥材5 g，加乙酸乙酯50 ml，回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷0.5 ml使溶解，即得板藍根對照藥材溶液。另取靛玉紅對照品，加二氯甲烷制成每1 ml含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》四部通則0502（2015年版）吸取上述七種溶液各 10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環己烷－乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的紅色斑點，陰性對照無干擾。結果見圖2。

圖 2 板藍根、大青葉的薄層鑒別

2.2 R，S-告依春含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適應性試驗［6］采用HPLC法，色譜柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速 1 ml/min；檢測波長245 nm；柱溫30℃；進樣量10 μl。理論塔板數按R，S－告依春峰計算應不低于3000。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取板柴口服液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 取R，S－告依春對照品10.26 mg，精密稱定，至100 ml量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為0.1025 mg/ml的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液4.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得41.00 μg/ml的對照品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺板藍根的陰性樣品5 ml，按照2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 系統適應性試驗 吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，分別按上述色譜條件測定，記錄色譜峰。結果樣品峰與其他組分良好分離，陰性樣品無干擾。結果見圖3。

2.2.6 線性關系考察 精密吸取R，S－告依春對照品儲備溶液（0.1025 mg/ml）1 ml，2 ml，4 ml，6 ml，8 ml置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，吸取10 μl注入色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度 μg/ml（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得 R，S－告依春回歸方程為：Y=72227X－39176，r=0.9999 （n=5）。結果表明，R，S－告依春在 10.25～82 μg/ml范圍內有良好的線性關系。

圖 3 R，S-告依春HPLC圖

2.2.7 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μl，重復進樣 6 次，記錄峰面積，結果 R，S－告依春峰面積的RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取同一批次樣品 （批號：150312）6份，按2.2.2項下制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積。按外標法以峰面積計算含量，結果樣品中R，S－告依春平均含量為63.18 μg/ml，RSD為0.81%，表明方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取2.2.8項下1號供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件，分別在 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進行測定，記錄峰面積。結果R，S－告依春峰面積的RSD為1.04%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品9份各2.5 ml，分別精密加入R，S－告依春對照品溶液（41.00 μg/ml），3.0 ml，3.8 ml，4.6 ml，各平行 3份；按2.2.2項下方法制備供試品溶液并進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.2.11 含量測定 取3批板柴口服液 （批號分別為 150312，150327，150506）， 每批各 3 份， 按照2.2.2項下制備供試品溶液，依法進行含量測定。由表2見，三批板柴口服液中R，S－告依春含量的均值為62.43 μg/ml，取其80%作為本標準的含量下限，為 49.94 μg/ml，即每 1 ml板柴口服液中含 R，S－告依春以（C5H7NOS）計，不得少于 49 μg。

3 討論

薄層色譜研究中，避免使用對人體及環境有害的三氯甲烷等試劑，所選試劑有利于環保。查閱大量文獻［6－8］，鑒別板藍根時多選用精氨酸作為對照品，但經研究發現，板藍根，柴胡，大青葉三者均含有精氨酸，專屬性不強。曾嘗試對該制劑中R，S－告依春進行薄層鑒別，但展開效果不理想。板藍根和大青葉來源于同一植物的不同部位，經多次試驗，二者均含有靛玉紅［9，10］，最終選擇靛玉紅作為對照品，來鑒別二者。因板藍根為方中主藥，故保留此鑒別方法。曾對該制劑中臣藥金銀花和魚腥草進行薄層鑒別，因二者均含有綠原酸［11，12］，陰性互相干擾，未采用。

在R，S－告依春含量測定中，有文獻報道，以水為提取溶劑［13］，該文比較了甲醇、乙醇、水 3種溶劑，結果三者提取率相差不多，但以水為溶劑，雜質峰較多，基線不穩，而以甲醇為溶劑提取，可醇沉除去部分雜質，雜質峰較少，基線更為平穩，主峰分離度更好，故選擇甲醇為提取溶劑。該課題組曾對本制劑中綠原酸進行了含量測定研究［11，12］，但經過長期穩定性試驗，該制劑在放置6個月后，綠原酸含量明顯下降，原因是綠原酸不穩定易分解，故未納入質量標準。

表 1 R，S-告依春加樣回收試驗（n=9）

表 2 三批樣品的含量測定結果

在制定質量標準時，應考慮有效成分轉移率的問題，一般以＞30%為宜。如果轉移率太低，由于中藥材質量參差不齊，可能會導致制劑中有時無法測到該成分或者含量達不到所定標準。在該試驗中，三批樣品R，S－告依春的轉移率分別為53.4%；50.8%；54.7%，生產工藝穩定可行，故選取該成分納入質量標準。

綜上所述，該實驗建立的R，S－告依春HPLC含量測定方法，簡便易行，靈敏度高，重復性好，可用于本制劑的質量控制。