高效液相色譜法測定原料藥中溴芬酸鈉及其雜質A含量

董 莉，魯 軍，竇 佳

（遼寧省大連市藥品檢驗所，遼寧 大連 116021）

溴芬酸鈉的化學名稱為2-氨基-3（-4-溴苯甲酰基）苯乙酸鈉，是制備眼部炎癥用藥的原料。其結構與酮洛芬和雙氯芬酸類似，能抑制環氧合酶介導的前列腺素類炎性介質的合成，具有強力消炎鎮痛作用，作用強度為其他非甾體抗炎藥的10倍［1-5］。其療效和安全性均較好，特別對于白內障術后眼部發炎、疼痛及畏光癥狀效果顯著［6-13］。本研究中建立的高效液相色譜（HPLC）法可測定原料藥中溴芬酸鈉及其雜質A的含量，且簡便快速、專屬性強、準確可靠，可有效控制該藥品的質量［14-16］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱；Empower工作站，Waters 2489型紫外／可見光檢測器，配備Waters 2998型二極管陣列檢測器（Waters公司）；PP-15E型酸度計，MSA 225s-100-DA型分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

溴芬酸鈉對照品（批號為WS／BRN／004-07）與溴芬酸鈉雜質A對照品（批號為WS／BRW／003-07，純度為96.8%），均由廠方提供；供試品為進口原料藥（Indoco Remedies Ltd，批 號 分 別 為 RK14BRN003，RK14BRN004，RK14BRN001）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：HypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-0.4%三乙胺溶液（用磷酸調pH至5.0）（55 ∶45）；檢測波長：266 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。在此條件下的色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取本品20 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀釋劑適量，超聲處理5 min，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取溴芬酸鈉對照品適量，精密稱定，加稀釋劑制成每1 mL含0.4 mg的溶液，搖勻，作為溴芬酸鈉對照品溶液。取雜質A對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液；精密量取對照品貯備液1 mL和供試品溶液0.5 mL，置同一50 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為溴芬酸鈉雜質A對照品溶液。避光操作。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

線性關系考察：稱取溴芬酸鈉對照品10，15，16，18，20，24，30 mg，精密稱定，分別置 50 mL 容量瓶中，加稀釋劑［甲醇-水（50∶50）］適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為溴芬酸鈉線性試驗溶液。取溴芬酸鈉雜質A［7-（4-溴苯甲酰基）-1，3-二氫-2H-吲哚 -2-酮］對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置另一50 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5，7.5，10，15，20 mL，分別置 100 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為溴芬酸鈉雜質A線性試驗溶液。按2.1項下色譜條件分別進樣2次，記錄色譜圖，以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，溴芬酸鈉為 Y＝4.658×105X-1.328×105，r＝0.9999（n＝7）；溴芬酸鈉雜質 A 為 Y＝2469X+2601，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，溴芬酸鈉及其雜質 A質量濃度分別在 0.2 ～0.6 mg／mL 及 0.2 ～0.6 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

穩定性試驗：取室溫避光放置 0，4，8，12，24 h 的供試品溶液，分別進樣測定。結果峰面積未見明顯變化，RSD為1.10%（n＝5），表明該溶液避光放置日內穩定性良好，能滿足測定要求。

精密度試驗：取批號為RK14BRN003的樣品，依法制備供試品溶液，連續進樣5次。結果溴芬酸鈉的平均含量為 99.99%，RSD 為 0.67%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為RK14BRN003）樣品5份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果溴芬酸鈉平均含量為 99.94%，RSD 為 0.44%（n＝5），表明方法重復性好。

回收率試驗：取線性關系考察項下的對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，每份樣品各進樣2次，測定，取平均值，計算回收率。結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝7）

檢出限和定量限確定：按2.1項下色譜條件，取線性關系考察項下溶液，稀釋成質量濃度為 4，0.4，0.04，0.004 μg ／mL 的溶液，分別取 10 μL，按擬訂色譜條件進樣分析。結果檢測限按信噪比（S／N）＝3∶1確定為1 ng／mL，定量限按 S／N＝10∶1確定為4ng／mL。

2.4 樣品含量測定

精密量取供試品溶液和溴芬酸鈉對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件操作，用外標法計算含量。精密量取供試品溶液和溴芬酸鈉雜質A對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件操作，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍，供試品溶液的色譜圖中，如有與雜質A保留時間一致的峰，則按外標法以峰面積計算，不得超過 0.10。詳見表 2及圖 2。

表2 樣品含量測定結果（%）

2.5 強制降解試驗

精密量取供試品溶液10 mL，分別精密加入30%過氧化氫溶液、稀鹽酸、氫氧化鈉溶液各1 mL，供試品溶液于60℃加熱1 h后、相對濕度80%放置2 h，供試品溶液于日光照射2 h后，依法制備，即得破壞性試驗a，b，c，d，e，f溶液，分別按擬訂色譜條件測定。結果表明，該色譜條件可以將溴芬酸鈉與各種條件下降解的有關物質分離。除80%相對濕度破壞影響不大外，其他溫度、光照有些影響（降解產物質量約增加0.1%），氧化破壞和堿破壞影響較大，而酸破壞時溴芬酸鈉幾乎全部被破壞。詳見圖3。

圖2 含量測定高效液相色譜圖

圖3 強制降解試驗高效液相色譜圖

3 討論

3.1 色譜柱耐受性考察

分別使用 Thermo BDS Hypersil C18柱（150 mm×4.6mm，5μm）、WatersSymmetryC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）、Unitary C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）以及Kromasil C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）等色譜柱分析供試品溶液溴芬酸鈉的雜質A與含量，其峰形及分離度均滿意，故認為本方法對色譜柱的耐受性良好。

3.2 穩定性考察

經試驗，該原料藥不穩定，避光放置3～30 d，含量平均下降1% ～2%；對光比較敏感，光照3～30 d，有關物質總含量由0.2%增加到3.5% ～5.0%。供試品溶液顏色由黃色變為橘黃色。這其中溴芬酸鈉雜質A的變化不大，而在相對保留時間0.9處及3.5處增加很多，故對其有關物質進行質量控制非常必要。

3.3 檢測波長選擇

以甲醇為溶劑，分別取溴芬酸鈉對照品、溴芬酸鈉雜質A對照品制成每1 mL含溴芬酸鈉及溴芬酸鈉雜質A10 μg的溶液，在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，結果溴芬酸鈉及溴芬酸鈉雜質A分別在266 nm及270 nm波長處有最大吸收峰。本研究中選擇在266 nm波長處測定溴芬酸鈉及雜質A的含量，效果滿意。

3.4 雜質A考察

用本方法所測得的溴芬酸鈉及溴芬酸鈉雜質A的含量與梯度試驗方法［3］比較，其結果完全一致。且有關物質多檢出1個雜質，消除了梯度帶來的基線波動造成的干擾，由樣品測定和回收率測定結果可知，該方法準確性好，精密度高，重復性好，適用于測定溴芬酸鈉原料及其中雜質A的含量。在加入鹽酸強制降解試驗中，溴被氯取代，且其保留時間與雜質A的保留時間一致。另外，在主峰相對保留時間0.9處均檢出含量約0.08%的1個固定雜質，未能確定成分，有待進一步研究。