黃芪補氣養血合劑質量標準研究

唐斌斌，杜書君△，郝保華

（1.山東省聊城市陽谷縣人民醫院，山東 聊城 252300； 2.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069）

黃芪補氣養血合劑是陽谷縣人民醫院經過20余年臨床實踐總結的有效方劑，由黃芪、當歸、補骨脂、白芍、女貞子、白術等10余味中藥組方，有補氣養血、健脾補腎功效，用于治療氣血虧虛、脾腎不足證引起的白細胞減少癥及術后氣血虛弱等癥效果良好。兩癥屬中醫“虛勞”“氣血虛”等范疇［1］，治療多采用扶正固本之法。為了確保黃芪補氣養血的質量穩定性和臨床有效性，本研究中建立了制劑中黃芪、白芍和補骨脂的薄層鑒別方法，以及當歸中阿魏酸含量的測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilengt 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；YP-5001型電子精密天平（上海良平儀器儀表有限公司）；YFX20／3+1型常壓循環3+1一體煎藥機（北京東華原醫療設備有限責任公司）；QH-2夾層鍋（郭店前中不銹鋼制品廠）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

試藥：黃芪甲苷對照品（批號為110781-201616），芍藥苷對照品（批號為110736-201438），補骨脂素對照品（批號為110739-201310），異補骨脂素對照品（批號為 110738-201313），阿魏酸對照品（批號為110773-201614），均購自中國食品藥品檢定研究院；黃芪補氣養血合劑（批號分別為20170515，20170518，20170522，陽谷縣人民醫院制劑室自制）；乙腈和磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純；試驗用水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

黃芪［2］302，［3-5］：取本品 20 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液20 mL洗滌，棄去氨溶液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法［2015年版《中國藥典（四部）》通則0502，以下簡稱“通則 0502”］試驗，精密吸取上述 3 種溶液各 2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以10℃以下放置分層的三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1A。

白芍［2］105，［6-7］：取本品 20 mL，加水飽和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液20 mL洗滌，棄去氨溶液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，精密吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1B。

補骨脂［2］187，［8-9］：取本品 20 mL，加乙醚 20 mL 振搖提取，取乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取補骨脂素、異補骨脂素對照品，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺補骨脂的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述4種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色熒光斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.085%磷酸溶液（15∶85）；檢測波長：316 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按阿魏酸峰計應不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得對照品溶液。精密量取本品3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，濾液經0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。取缺當歸藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜峰。結果供試品溶液和對照品溶液色譜在相同保留時間處有色譜峰，陰性無干擾，且分離度較好，表明方法專屬性好。詳見圖2。

線性關系考察：精密吸取質量濃度為15 μg／mL的阿魏酸對照品溶液 1，2，4，8，12 μL，按擬訂色譜條件分別進樣測定，以阿魏酸進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝24 895X-45.323，r＝0.999 9（n ＝5）。結果表明，阿魏酸進樣量在0.015 ～0.180 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為15 μg／mL的阿魏酸對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.83%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批號為20170515），分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定阿魏酸的峰面積。結果的 RSD為1.02%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為20170515）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件測定。結果阿魏酸的平均含量為 28.68 μg／mL，RSD 為0.98%（n＝6），表明方法重復性良好。

圖2 高效液相色譜圖

加樣回收試驗：精密量取已知含量（阿魏酸含量為28.72 μg ／mL）的樣品 6 份，每份 1 mL，分別精密加入質量濃度為15 μg／mL的阿魏酸對照品溶液各2 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果批號為20170515，20170518，20170522的3批樣品中阿魏酸的含量分別為 28.61，28.83，29.13 μg ／mL。

3 討論

參考《中國藥典》及有關文獻，曾對該制劑中的主要藥材進行薄層鑒別，其中黃芪、白芍、補骨脂的薄層鑒別斑點清晰，陰性對照無干擾。本研究中對黨參進行薄層色譜鑒別，由于黨參中主要成分為黨參炔苷，極性較大，采用不同方法處理樣品［2］281，［10-11］，均無法完全排除陰性干擾，故未建立黨參的薄層色譜鑒別方法。

當歸補血活血，為黃芪補氣養血合劑的主要藥味，對其指標成分阿魏酸進行了含量測定研究。阿魏酸極性較大，在熱水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶劑中均有較好的溶解性，故供試品溶液制備方法可采用直接稀釋法或萃取法［12］，本研究中采用甲醇直接稀釋法，與藥典所載70%甲醇提取法基本一致。測定阿魏酸含量時，考察了不同體系和不同比例的流動相［乙腈-0.1%磷酸溶液（17 ∶83）［13］、甲醇 -0.1% 磷酸溶液（30 ∶70）［14］、甲醇 -0.8% 冰醋酸液（22 ∶78）［15］］，色譜峰分離程度均不理想，經過多次試驗，適當調整后，結果以乙腈-0.085%磷酸溶液（15∶85）為流動相得到的色譜峰分離度較好，陰性對照無干擾。

本研究中確立了黃芪補氣養血合劑中黃芪、白芍和補骨脂的薄層鑒別方法及當歸中阿魏酸的含量測定方法，試驗結果表明，該方法操作簡單，靈敏度高，重復性好，專屬性強，可用于黃芪補氣養血合劑的質量控制。