高效液相色譜法測定大黃滴眼液中黃芩苷含量*

林 夢 ，蔣 斌 ，張華峰 ，王玳珠 △，吳慶瑜

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院·蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000； 2.江蘇省蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000； 3.江蘇省蘇州市體育運(yùn)動(dòng)學(xué)校，江蘇 蘇州 215000）

大黃滴眼液由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院眼科自制，集中藥理法、西藥使用方法于一身，功效為清熱解毒，主要用于治療各種類型的結(jié)膜炎，特別是慢性結(jié)膜炎，臨床研究顯示，該藥療效比西藥抗生素滴眼液佳。該藥主要中藥成分為大黃和黃芩，其中黃芩具有抗菌、抗病毒作用，其抑菌的有效成分為黃芩苷［1-2］。現(xiàn)行大黃滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對黃芩苷進(jìn)行測定［3］，為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究中結(jié)合 2015 年版《中國藥典（四部）》［4］和文獻(xiàn)［5-15］，采用高效液相色譜法測定其黃芩苷含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀，包括2998二極管陣列檢測器，Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國Waters公司）；Milli-Q型純水機(jī)（美國密理博公司）；AG285型電子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）；KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 試藥

大黃滴眼液（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院自制，批號分別為140312，140324，140331，規(guī)格為每支 8 mL）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110715-201117）；冰醋酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，Sigma-Aldrich公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -水 -冰醋酸（45 ∶55 ∶1）；檢測波長：315 nm；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品12 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備溶液。

供試品溶液：精密量取本品5 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

陰性對照品溶液：取不含黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果供試品溶液色譜與對照品溶液色譜在相應(yīng)保留時(shí)間處均出現(xiàn)黃芩苷峰，且峰形良好，無雜質(zhì)干擾，保留時(shí)間約為7.5min。陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取黃芩苷對照品貯備溶液10 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。取對照品溶液，分別進(jìn)樣 2，4，6，8，10 μL，取對照品貯備溶液分別進(jìn)樣10 μL和20 μL。記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷回歸方程 Y＝23 118X-79 768，r2＝0.999 9（n＝7）。結(jié)果表明，黃芩苷溶液質(zhì)量濃度在 21.787 9 ～435.758 4 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取黃芩苷對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芩苷峰面積。結(jié)果的 RSD為0.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批供試品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.95%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

最低檢出限和最低定量限確定：經(jīng)檢測，黃芩苷最低定量限為 0.174 μg／mL（S／N ＝10）；最低檢出限為0.087 μg／mL（S ／N ＝3）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣 10 μL，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1.23%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品，精密量取2mL，取6份，分別精密加入黃芩苷對照品貯備液 2.0，2.5，3.0 mL。依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定黃芩苷的色譜峰面積。結(jié)果3批（批號分別為140312，140324，140331）樣品中黃芩苷的含量分別為0.24，0.22，0.25 g ／L。

3 討論

3.1 測定波長選擇

經(jīng)在線全波長紫外吸收光譜掃描分析，黃芩苷在315 nm波長處有良好的紫外吸收強(qiáng)度。本研究中，采用315 nm作為檢測波長時(shí)，黃芩苷為主要吸收峰，分離度好，峰形良好，且其他物質(zhì)對測定無干擾。

3.2 流動(dòng)相和柱型選擇

本研究中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)測定黃芩苷的差異，采用甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)測定黃芩苷內(nèi)有干擾色譜峰，而甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)能去除干擾，明顯改善黃芩苷色譜峰的分離。由于其他藥味中的化學(xué)成分干擾黃芩苷的測定，故選擇了多型號的反相硅膠色譜柱進(jìn)行比較，最后采用Waters Symmetry C18柱，取得了良好的分析效果。

3.3 提取方法選擇

在樣品提取中，考察了甲醇、水、70%甲醇對大黃滴眼液中黃芩苷提取率的影響，結(jié)果70%甲醇的提取效率高于甲醇和水，最終采用70%甲醇提取黃芩苷。

3.4 滅菌方法選擇

眼用制劑屬無菌制劑［4］，大黃滴眼液中的黃芩苷具有熱不穩(wěn)定性［1］，試驗(yàn)中考察了過濾和輻照2種滅菌方法對大黃滴眼液中的黃芩苷含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過濾滅菌法對大黃滴眼液中黃芩苷的含量無影響，而輻照滅菌后難以測出其含量。

綜上所述，本研究中建立的高效液相色譜法，操作簡單，分析快速，精密度高，穩(wěn)定性好，空白無干擾，可為提高大黃滴眼液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。